生物标志物研究与早期药物研发基因表达分析功...（四）
FFPET 样本特异性RealTime ready qPCR检测潜在生物标志物假设检验
我们使用的第一套临床样本来自于各种用于人类研究的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织。肿瘤来源的
FFPE 组织是临床试验或生物标志物研究中，治疗复合物研发最具有相关性的样本材料。使用 High Pure RNA Paraffin
试剂盒，从 FFPE 组织（例如：10um切片）中提取RNA，修订操作方案见“材料与方法”
章节的描述，其后是特异性优化与功能学检测RealTime ready RT-qPCR分析。
由于福尔马林固定，以及保存条件的原因，FFPET样本分离RNA呈片段状（7）。对于FFPET来源的RNA来说，为提高灵敏性与重现性，使用长度小于100bp的小片段扩增子非常重要。RealTime ready 检测专用于小片段扩增子的扩增。所有扩增参数均应是RNA特异性，无人类基因组DNA污染。可通过引物探针设计来避免污染，引物探针序列可跨越外显子-内含子交界区。假基因应该是无法扩增的，但并不是所有假基因均已知，或已被发表，必须在对照反应中，使用人类基因组DNA进行假基因检查。RealTime ready 专用于各种 FFPE 来源的，用于人类研究的肿瘤样本（例如：BC、CRC）的分离 RNA 检测，并受到各种 FFPE 来源用于人类研究的肿瘤样本分离RNA检测的检验。根据以下参数，进行最佳RealTime ready RT-qPCR检测选择：灵敏性、线性度、重现性与特异性。根据所感兴趣组织中参数表达级别，cDNA合成所用特异性引物灵敏性应该更高（参见图 5）。
A) 生物标志物 3/肾随机引物 B) 生物标志物 3/FFPET BC随机引物 C) 生物标志物 3/FFPET BC特异性引物 图 5：潜在“生物标志物 3”RealTime ready qRT-PCR 扩增曲线。来自肾
RNA（A）与 FFPE 乳腺癌（BC）样本（B 与 C）系列稀释 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀释的
PCR 反应混合物（A 与 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀释的 PCR 反应混合物（C）进行 PCR
启动。C中，使用特异性引物而不是随机引物进行cDNA合成启动，以提高灵敏性。
Cq值见表 1。
结论
使用体内以及体外模型，假设生成生物标志物研究中，以及人
FFPE研究样本假设检验中，可成功应用RealTime ready RT-qPCR
检测。已经确立并对不同样本工作流程方案进行描述。使用
High Pure RNA Paraffin试剂盒，可从FFPE组织样本中分离出RNA，
通过RealTime ready检测，可进行qRT-PCR分析。
参考文献
1. NIH Biomarker Definitions Working Group, Clin Pharmacol Ter 2001; 69: 89–95.
2. Winkles, J. A. (2008) Nature Reviews, Drug Discovery 7(5): 411–25.
3. RDR report # 1042689 (Draft vers. April 2011)
4. Bustin, S.A., et al. (2009) Clin Chem 55 (4): 611.
5. Vandesompele, J. et. al. (2002) Genome biology 3 (7)
6. de Koning, P. & Keirns, J. (2009) Biomarkers Med 3(6): 685–700.
7. Masuda, N., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (22): 4436–43.
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仅用于生命科学研究。不可用于临床诊断。
LIGHTCYCLER、MAGNA PURE、HIGH PURE与REALTIME READY是罗氏公司注册商标。
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