生物标志物研究与早期药物研发基因表达分析功...（二）
材料与方法
细胞培养
于标准条件下进行肿瘤细胞系（ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1）培养。使用TWEAK或
Anti-TWEAK（RO5458640）分别对细胞进行处理。于不同时间点收集肿瘤细胞系（0、6、24
小时），将RNA样本存放（Qiagen）。
细胞 RNA 分离
使用MagNA Pure LC 仪、MagNA Pure LC
RNA Kit –High Perfor-mance（Roche，货号：03 542 394 001），与MagNA Pure LC
程序“RNA HP Cells”从细胞小球中分离总体细胞 RNA。溶解并混合细胞裂解物（1 x 106细胞每 600 µl RLT
缓冲液[Qiagen，货号：79216]），并将 2 x 200 µl细胞裂解物转移至MagNA Pure Sample Cartridge
wells（200 µl每孔）。洗脱裂解液重复分离制备的 RNA 至 50 µl，并收集洗脱液。FFPE 组织 RNA 分离使用 High
Pure RNA Paraffin 试剂盒（Roche，货号： 03 270 289 001），根据操作手册（福尔马林固定、石蜡包埋组织 RNA
分离方案），从10um FFPET 切片中分离总体细胞 RNA, 经过调整的技术操作步骤如下：1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30
分钟；第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分钟；室温 High Pure 柱上DNase处理 15
分钟。经过调整的技术操作步骤更加快速、上机时间更短，显示其性能具有可比性。
RNA 质量控制
使用NanoDrop仪器进行RNA制备物质量与定量分析。使用Agilent生物分析仪与RNA Nano芯片进行某些样本RNA完整性分析。
cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master（Roche，货号：05 893 151 001）与 1ug 总体RNA进行cDNA合成。每份样本均建立3份独立的40µl反应液。逆转录系列RNA稀释液，并分别进行浓缩产物PCR。
实时qPCR
进行 1g 总 RNA 3
份cDNA合成反应混合液、稀释处理，并将其作为模板，用于RealTime ready Custom Panel Plate,
384（Roche，货号：05 582 873 001）。使用LightCycler® 480 Probes
Master（Roche，货号：04 707 494 001）进行含有RNA的反应混合物制备。
每孔总体PCR反应容积是10 µl，终RNA容量是10ng。罗氏公司为每个仪器配备有LightCycler® 480 软件，版本1.5，以及content.txt文件，从而使样本设置与结果分析更加容易。
结果与讨论
NF-kB RealTime ready Custom Panel体外细胞系研究筛选出35种差异表达基因。
为生成首个预测性与药效学标志物假设，我们使用一种多参数panel（92 种靶序列与 4 种看家基因），该panel涵盖有 NF-kB途径，以及广泛的基因表达筛查方法。使用该panel是为建立高通量工作流程，并使操作更加方便。使用相关复合物处理过的肿瘤细胞系，进行首个体外研究。以MagNA Pure LC 仪器自动 RNA 分离、具有RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板的、384-孔格式的LightCycler® 480 仪器 RT-qPCR与cDNA合成为起点，使工作流更加便利、快速，并进行相关基因表达分析。
工作流描述：NF-κB RealTime ready 定制型多孔检测板体外研究
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会议会展
