【锐赛小课题】染色体分离实验
一、聚胺法分离染色质
试剂、试剂盒：秋水仙胺、聚胺缓冲液
实验步骤：
有丝分裂中细胞的同步化
1. 37℃，用合适的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培养基培养细胞。
2. 收集有丝分裂细胞前 10~16 小时在培养基中以 0.06 μg/ml 的浓度加入秋水仙胺。
收获细胞并在聚胺缓冲液中裂解
3. 收获细胞。
对于悬浮培养细胞（500 ml 培养基），室温 1500 g 离心 5 分钟收获细胞。在室温用聚胺缓冲液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 离心 5 分钟收集细胞。
聚胺缓冲液：
15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
0.2 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 精咪
2 mmol/L EDTA
80 mmoI/L KCl
0.1 mmol/L PMSF（临用前从用 100% 乙醇制备的 1 mmol/L 的贮存液中加入）
4. 细胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黄皂苷的聚胺缓冲液重悬浮。
5. 用 Dounce 匀浆器和 B 研棒进行 10 次温和匀浆裂解细胞（过于剧烈的匀浆会导致染色体明显损伤）。另外也可以将悬液温和地吸到一塑料注射器中，然后推动便其通过 25 号针头（应避免溶液起泡沫）。
6. 细胞裂解后，取出少量裂解液观察染色质释放情况。在有一滴用来进行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分离缓冲液溶液的载玻片上，滴一滴裂解悬液。用荧光显微镜观察染色质。
7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的悬桶式转头在 250 g 离心 1 分钟沉淀裂解液去除碎片。
8. 取出含有染色体的上清，3000 g 离心 15 分钟。
9. 将含有染色体的沉淀重悬浮于 5~10 ml 的聚胺缓冲液中。制备的染色体可以在 4℃ 保存。保存 2~4 个星期后观察不到形态的变化；但对于特殊目的的研究（例如酶活性，不稳定蛋白），得到的染色体应立即使用。
二、水相法分离染色质
试剂、试剂盒：水相裂解缓冲液
仪器、耗材：离心机
实验步骤：
像聚胺法的第 1、2 步中讲的那样诱导悬浮或单层培养细胞的中期阻遏状态。
2. 细胞在 4℃，1000 g 离心 10 分钟然后重悬浮，典型的制备量为 10 ml 新鲜培养基含 108 个细胞。
3. 将浓的细胞悬液在冰上放置至少 30 分钟冷却以帮助有丝分裂复合物的完全解离。
4. 4℃ 1000 r/min 离心 10 分钟沉淀细胞。
5. 沉淀用 10 ml 75 mmol/L 的 KCI 重悬浮，4℃ 孵育 20 分钟进行低渗溶胀。
6. 4℃ 1000 r/min 离心溶胀细胞。
7. 将细胞重悬浮于 10 ml 的水相裂解缓冲液中，温和揽拌，冰上放置 5 分钟。
水相裂解缓冲液：
10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
120 mmol/L KCl
20 mmol/L NaCl
0.1 % Triton X-100
含 2 mmol/L CaCl2 的 0.1 mmol/L PMSF
8. 将悬液温和地反复通过一 25 号皮下注射针头大约 10 次或用 Dounce 匀浆器破碎法使细胞完全裂解（避免产生气泡）。
9. 将破碎的细胞在 4℃ 400 g 离心 3 分钟去除细胞核，上清移至一干净的离心管中。
10. 4℃ 3000 g 离心上清 15 分钟以浓缩染色体。
三、用己二醇法分离中期染色质
试剂、试剂盒：己二醇缓冲液
仪器、耗材：Dounce 匀浆器
实验步骤：
按聚胺法第 1 和 2 步中所述诱导 500 ml 悬浮或单层培养细胞为中期阻遏状态。
2. 细胞在 4℃ 1000 r/min 离心 10 分钟，用 10 ml 培养基重悬浮。
3. 将重悬浮的细胞冷却至 4℃ 放置 20 分钟。
4. 细胞在 4℃ 1000 r/min 离心 4 分钟，取出培养基。
5. 在 4℃ 用己二醇缓冲液清洗细胞，按第 4 步进行离心。
己二醇缓冲液：
1.0 mol/L 己二醇（2-甲基-2，4 戊二醇）
0.5 mmol/L CaCl2
0.1 mmol/L PIPES，pH 6.5
6. 用 10 ml 冷己二醇缓冲液温和地重悬浮细胞，37℃ 孵育 10 分钟。
7. 缓慢地将细胞悬液通过 25 号针头注射器或用 Dounce 匀浆器匀浆 10 次（避免产生过多气泡）。
8. 染色体悬液粗品用 JA-20 转头（Beclanan J-21 离心机）在 4℃ 5000 r/min 离心 15 分钟进行浓缩。
四、蔗糖梯度纯化法
实验材料：染色质粗品
试剂、试剂盒：聚碳酸酯离心管
仪器、耗材：Dounce 匀浆器
实验步骤：
1. 准备两种 18ml，浓度分别为 20% 和 60% 的蔗糖分离缓冲液（聚胺，水相或己二醇法的缓冲液），然后以线性形式加到一 50 ml 的聚碳酸酯离心管中，用梯度生成器形成沿离心管的密度梯度。
2. 将染色质粗品溶液轻轻地加到梯度上，用带吊桶式转头的 JS-13 ( Beckman Instruments ) 或 HB-4 ( Sorvall) 离心机在 2500 g 离心 15 分钟。
3. 3 ml —份轻轻地从梯度顶部取出样品，取少量用相差显微镜检查染色质的存在情况。
4. 收集含染色体的组分在 3000 g 离心 10 分钟。
5. 用大约为起始染色体粗品溶液体积 1/30 的分离缓冲液重悬浮染色体，继续下一步研究。
五、Percoll梯度法
实验材料：染色质
试剂、试剂盒：精胺、精咪、Percoll、溶液
仪器、耗材：聚碳酸酯离心管
实验步骤：
1. 在体积为 10 ml 分离得到的染色质物质中加入精胺和精咪至终浓度分別为 0.8 mmol/L 和 2 mmol/L。
2. 加入 10 ml Percoll 溶液，匀浆分离得到的染色质。
Percoll 溶液：
89% (v/v) Percoll
5 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
2 mmol/L EDTA
0.8 mmol/L 精胺
2 mmol/L 精咪
0.1 % 毛地黄皂苷
3. 再加 15 ml Percoll 溶液到匀浆中，充分混匀。
4. 将 35 ml 的 Percoll 混合物加入 50 ml 的聚碳酸酯离心管中，用一固定角度转头（Beckman Instruments) 在 4℃，20000 r/min 离心 30 分钟。
5. 吸出染色体带上面的全部物质，将梯度中的染色体回收于大约 10 ml 的 Percoll 溶液中。
6. 为了除去 Percoll 颗粒，以 1:2 比例用稀释缓冲液稀释染色体，1400 g 离心 45 分钟进行浓缩。
六、甘油梯度法
实验材料：染色质
试剂、试剂盒：甘油、染色质、分离缓冲液溶液
仪器、耗材：JS-13 转桶式转头
实验步骤：
1. 准备 5 份 6 ml 的 10%、20%、30%、40%、50%（v/v）甘油/染色质分离缓冲液溶液。
2. 用 JS-13 转桶式转头在 4℃，1000 r/min 离心 50 分钟进行染色质梯度沉降。
3. 以 3 ml —份收集梯度顶部组分。
4. 每一组分固定少量样品（10~20 ml）于载玻片上，用相差显微镜观察确定含染色体的组分。
5. 收集含有纯化的染色体的样品。
6. 制备得到的样品用 JA-20 转头在 4℃，5000 r/min 离心 15 分钟以除去其中的甘油，用分离缓冲液重悬浮染色体沉淀。
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