实时荧光定量 PCR
Thomas D. Schmittgen
Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,
Washington State University, Pullman, WA 99164.
对于从 90 年代初就开始接触定量 PCR 的实验人员来说，他们早已对繁琐的定量方法习以为常。早期定量 PCR 技术的难点主要在于：（ 1 ）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内（只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（ 2 ）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的 cDNA (1) 或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整 (2) ；有的研究者加一个竞争性模板 (3) ，有的做限制性的稀释梯度分析 (4) ，或者加一个 PCR 模拟（ mimic ）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增 (5) 。而扩增产 物的检测通常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。
对于已经开始使用实时定量 PCR 的研究者来说，过去的日子已经一去不复返了。在实时 PCR 中，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据。现在在 2 到 3 小时之内拿到数据已经不再是梦想。除此之外，实时 PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大大减少；可以进行多重 PCR 反应，而且不需要后期处理。
PCR 实时检测技术从诞生到现在已经有五年了，但是其应用在近两年才开始迅猛增长。在 Medline 数据库中，用" Taqman "或" real-time and PCR" 作为关键词搜索，在 1996 年有 19 篇文章，在 1997 年有 28 篇文章，在 1998 、 1999 、 2000 年文章数分别达到了 52 、 157 和 409 篇。在这篇文章写作的同时，在 2001 年已经可以找到 551 篇文章了。许多厂商也正在大力宣传实时荧光定量 PCR 仪及其相关的技术（包括软件、探针等），而且在不久的将来，会有更多的产品发布。针对实时定量 PCR 这一热点领域，我们收集了许多目前用实时定量 PCR 来定量 DNA 或 RNA 的方法，汇编成 9 篇文章，涵盖了从 mRNA 和病毒 DNA 定量到 DNA 的甲基化和单核甘酸多态性的扩增检测。
Giulietti 等人描述了通过实时 PCR 对 cytokine 基因表达进行定量的方法。因为这一类基因在免疫的诸多方面都起着非常重要的作用，读者会发现这篇文章非常有用，特别是文中列出了许多 cytokine 基因和看家基因的引物和探针序列。就象大多数方法一样，这篇文章描述的定量检测 cytokine 基因表达的方法可以外推检测许多不同种类的 mRNA 。同时这篇文章也对实时定量 PCR 做了一个很好的综述，包括探针的化学原理和仪器介绍。我们推荐这个领域的所有新手应该先读读这篇文章。
对于 DNA 或 RNA 的常规定量来说，有两种定量方法：绝对定量和相对定量。绝对定量检测模板数的精确拷贝数，通常要用到标准曲线。在 Niesters 的文章里讨论了绝对定量用于病毒载量分析的方法。而相对定量能给出样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。通常，给出基因表达的相对变化就足够说明问题了，并不需要给出绝对量的变化。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时。对于那些想得到相对表达数据的研究者来说， Livak 和 Schmittgen 文章中的公式对于数据分析是非常有用的。这篇文章描述了 2 - ΔΔ CT 方法的推倒 、假设和 2 - ΔΔ CT 在基因相对表达分析中的实际应用。文章中也讨论了 2 - ΔΔ CT 方法的两种衍生方法，以及数据分析的一些小窍门。包括表格设计等。 Lehmann and Kreipe 等人在他们的 文章中将 2 - ΔΔ CT 方法用于病人标本的定量研究。
cDNA 芯片和差异显示是两种最常用的高通量筛选基因表达差异的技术。这两种技术的缺点在于它们只是定性而非定量分析，因而需要用一个定量的方法确认基因表达的差异，而实时 PCR 就是非常合适的一种手段。 Rajeevan 等人的文章描述了一种利用 SYBR-Green I 通过实时 PCR 检测产物并进行熔解曲线分析的方法，并用该方法对 cDNA 芯片和差异显示 PCR 技术的结果进行了确认。将实时 PCR 和高通量方法的结果相互比较就能对这个基因是否真的存在表达差异进行确证。相对于 Taqman 探针而言， SYBR-Green I 更高的灵活性使其被用于高通量筛选出的基因的快速确证。
另一个实时 PCR 方法应用的例子是 DNA 甲基化的检测。 CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5’- 甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。 Laird 和他的合作者使用了一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异实时 PCR 技术。在扩增之前， DNA 经重硫酸纳处理，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样， Methylight 无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的 DNA 检测中被证明 （ 6 ） 。
实时 PCR 可以分辨点突变，已经被广泛应用于遗传分析。 Sevall 描述了一个直接用实时定量 PCR 区分等位基因的方法。有不同的荧光报告基团标记的 Taqman 探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。实时定量 PCR 的数据被标在 xy 坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对 96 个样本进行基因分型。
另一个核酸定量的重要应用领域是活体切片检查。世界各地的病理系都储存有大量的福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片。过去如何利用这些活体切片存在许多困难，包括抽提核酸（特别是 RNA ），在切片中分离特定组织（如癌症组织和正常组织）。正如 Lehmann 和 Kreipe 文章中所讨论的，激光显微切片技术结合实时 PCR 技术很大程度上提高了在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行常规分析的能力。文章讨论了各种实验室不同的固定条件对核酸扩增的影响。读者会从文中找到许多有用的实验方法：包括从固定液的组成，最佳的固定条件以及激光辅助显微解剖技术。同时文章也讨论了如何在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行 DNA 甲基化分析的方法。
实时 PCR 不仅仅增强了我们进行常规定量分析的能力，也提高了我们高通量筛选的能力。一个明显的例证是实时 PCR 和分子信标的结合正在成为检测单核苷酸多态性的的新方法。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定的药物的不同反应有着重要的意义。 Mhlanga 和 Malmber 在文章中，对用分子信标实时检测 SNP 的技术和方法做了很好的综述。分子信标是双标记的荧光探针，由两个部分组成：一个环状区与目标序列完全配对，一个自身配对的茎区。在环区和目标序列配对之前，荧光被淬灭基团淬灭。一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变的简单而准确。引物或分子信标设计的方法和原则、反应条件、数据分析在文章中都有详细的讨论。文章中还包括了一个用分子信标检测雌激素受体的特异性等位基因的例子。
在同一反应中同时检测多种 PCR 产物（如多重 PCR ）已经有 10 年了。在传统的多重 PCR 反应中，不同的扩增产物通过在胶中不同的迁移速率进行检测 (7) 。 Wittwer 等人描述了实时多重 PCR 的方法和应用。这个实验是在一个快速循环的 PCR 仪的玻璃毛细管中进行的．它只采用了一个荧光探针，而不是两个荧光探针。多重 PCR 可以通过检测不同颜色或温度或者同时检测颜色和温度来区分。随着技术的进步，现在已经能在多重 PCR 反应中同时检测四种颜色。将温度和颜色组合，实时 PCR 可以检测每个反应中高达 12 个的产物。在这篇文章中，多重实时 PCR 被用在了等位基因检测和突变筛选中。
准确的对动植物或者是人中病毒感染的细胞进行定量无疑是很重要的。这个领域发展非常快，而实时 PCR 在其中扮演了一个很主要的角色。 Niesters 描述了用实时 PCR 定量病毒载量的方法。这篇文章也是讨论实时 PCR 是否能用于常规诊断的文章之一。在文章中给出了 DNA 和 RNA 病毒检测的方法步骤。在这篇文章中也讨论了所谓的 NASBA 技术（ nucleic acid sequence-based amplification ），它是一种等温的 RNA 扩增反应，初始 RNA 被扩增成与模板互补的 RNA ，而分子信标被用来检测这种 RNA ，这其中没有任何背景 DNA 的扩增。这种方法对反转录病毒的定量特别有用。文章还包括了关于标准曲线和准确性的讨论以及不同实验室在定量病毒载量时是否需要内标的讨论。
PCR 技术在 80 年代中期出现后，又有许多技术上的新发展。在实时 PCR 出现之前的所谓定量 PCR ，需要特别的训练、严格的测试和特别准确的加样。而实时 PCR 的出现使得科学家能用一个相对直接的方法研究许多基本而重要的问题。同时实时 PCR 作为常规诊断的手段虽然还有许多困难需要克服，但已经被确立。实时 PCR 在短时期内迅速崛起，它的诸多优点使得旧的实验方法被打入冷宫。虽然我们还会记起那些老的实验方案，但毫无疑问，它们以后再也用不上了。
参考文献
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