磺胺二甲基嘧啶快速测定法介绍
对于磺胺二甲基嘧啶残留的检测,由于微生物抑制分析方法缺乏灵敏度和特异性,所以高压液相色谱是最常采用的方法,然而 HPLC 方法的缺点是制备样品要耗费大量时间,并且需要昂贵的实验室设备。酶标免疫分析定量测定磺胺二甲基嘧啶残留方法适于做日常大量样品的筛选工作,特别是近年发展的试剂盒为快速筛选提供了途径。竞争酶标免疫法可以定性和定量测定牛奶、肉类及肾脏中的磺胺二甲基嘧啶残留。如果进行定量分析,必须有微孔板酶标仪。下面介绍目前流行的试剂盒筛选方法,以德国 r-Biopharm 公司的产品RIDASCREEN 试剂盒测定肉中及牛奶中的磺胺二甲基嘧啶残留为例。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。
1、测定原理
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔 IgG(磺胺二甲基嘧啶抗体)的羊抗体。加入磺胺二甲基嘧啶抗体,磺胺二甲基嘧啶酶标记物,标准或样品溶液。游离磺胺二甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶酶标记物竞争磺胺二甲基嘧啶抗体,同时磺胺二甲基嘧啶抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去将酶基质(过氧化尿素)和发色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm 处测量,吸收光强度与样品中的磺胺二甲基嘧啶浓度成反比。
2、试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个测量(包括标准分析孔),盒中的材料包括以下内容。
(1)96孔板(12条×8孔)包被有羊抗体。
(2)磺胺二甲基嘧啶浓缩标准液(0,10μg/kg,30μg/kg,90μg/kg,270μg/kg,810μg/kg)。
(3)磺胺二甲基嘧啶过氧化物酶标记物浓缩液。
(4)磺胺二甲基嘧啶抗体浓缩液。
(5)含有过氧化尿素的酶基质。
(6)四甲基联苯胺发色剂。
(7)1mol/L 硫酸反应停止液。
(8)缓冲液。
3、样品处理
样品应当在暗处及冷藏保存。
(1)牛奶样品应当用缓冲液以1:10稀释(50μL牛奶+450μL 稀释了的缓冲液),使用前将缓冲液用蒸馏水稀释20倍。取50μL 进行测定。
(2)脂肪奶应当离心在10℃ 10min 3000g 离心力,撇去脂肪后用缓冲液稀释液以1:10稀释(50μL牛奶+450μL稀释了的缓冲液)。取50μL 进行测定。
(3)肉及肾脏样品(定量) 样品去除脂肪并粉碎,取5g 与20mL 乙腈-水溶液(86+16)混合10min。
①15℃离心10min 3000g 离心力。
②3mL 上清液与3mL 蒸馏水混合,加入4.5mL 醋酸乙酯混合10min。
③15℃离心10min,以3000g 离心力。
④将醋酸乙酯层转移至另一瓶中完全干燥,用1.5mL 稀释了的缓冲液溶解干燥的残留物(使用前将缓冲液用蒸馏水稀释20倍备用)。
⑤加入1.5mL 正已烷混合5min,以进一步去掉脂肪。
⑥15℃离心10min 3000g 离心力,完全除去正已烷相(上层)取50μL 水相进行分析。
(4)肉及肾脏样品(定性)
①用新鲜或冷冻的肉样,在室温下解冻肉样,用蒸馏水洗涤并用吸水纸吸干样品上的水。
②称1g 去掉脂肪的肉样放入小瓶中,加10mL稀释了的缓冲液(使用前将缓冲液用蒸馏水稀释20倍备用)。
③用均质器在13500r/min 均质30s,或混合器混合3～5min。
④室温离心10min 4000g 离心力。
⑤用移液器小心转移出上清液(注意:避免脂肪层)。
⑥取50μL 上清液进行分析。(注意:如果需要,在2～8℃保存提取的上清液,但要在当天进行分析。上清液在20℃可保存3个月,在分析样品之前应将样品回到室温。)
(5)蜂蜜
①取2g蜂蜜,放入离心管中,加入4mL双蒸水溶解。
②加4mL 乙酸乙酯振荡10min(上下)。
③室温3000g 离心力离心10min。
④移取1mL 上层的乙酸乙酯(相当于0.5g样品)至另一试管中,60℃氮气流下蒸干。
⑤残留物用0.5mL 缓冲液溶解。
⑥取50μL 进行分析。
样品稀释倍数为1,检测下限达到1μg/kg,定量下限为3μg/kg。
4、分析测定
(1)制备磺胺二甲基嘧啶标准应用液:取50L 标准浓缩液用450μL 稀释了的缓冲液稀释并混合均匀,分别制成1μg/L,31μg/L,91μg/L,271μg/L,81lμg/L,用玻璃瓶保存当测定牛奶样品时,用稀释了的缓冲液配制。
(2)将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验,记录下标准和样品的位置。
(3)加入50μL 稀释的酶标记物到微孔底部,再加入50μL 的标准或处理好的样品到各自的微孔中,标准和样品做两个平行实验。
(4)加入50μL 稀释的抗体溶液到每一个微孔底部充分混合,在室温孵育2h,覆盖上薄膜(防止蒸发)。
(5)倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。用250μL 蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,再重复操作两次。
(6)加入50μL 基质和50μL 发色试剂到微孔中,充分混合并在室温暗处孵育30min。
(7)加入100μL 反应停止液到微孔中,混合好在450nm 处测量吸光度值(以空气为空白),必须在加入停止液后60min内读取光度值。
对于定性分析,单孔实验就可以了。
5、结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
标准的吸光度值(或样品)/0标准的吸光度值×100=吸光度值%
计算的标准值绘成一个对应磺胺二甲基嘧啶浓度(μg/kg)的半对数坐标系统曲线图相对应每一个样品的浓度(μg/kg)可以从校正曲线上读出。
为了获得样品中的磺胺二甲基嘧啶的实际浓度(μg/kg)从校正曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的稀释系数。当样品处理过程是按指示进行的,稀释系数为牛奶样品10、肉类样品2、血清样品4、蜂蜜样品1。
6、灵敏度
RIDASCREEN 磺胺二甲基嘧啶试剂盒的平均检测下限约为1ug/kg。根据样品处理记录,在牛奶中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为10μg/kg,在肉类及肾脏中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为2μg/kg,蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为1μg/kg。
