污染物致突变性检测试验方法
①斑点试验。吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1mL,注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中,需S-9活化的再加0.3~0.4mL S9mix(TA98 菌株的代谢活性剂),立即混匀,倾于底平板上,铺平冷凝。用灭菌尖头摄夹灭菌圆滤纸片边缘,纸片浸湿受试物溶液,或直接取固态受试物贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照,分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养4h,若纸片外围长出密集菌落圈,为阳性;菌落散布,密度与自发回变相似,为阴性。显然,只有在琼脂中弥散的化合物才能用此法检测,而且在整个平板中只有少量细菌与受试物接触,故敏感性差,这是该法的局限性。
②平板掺入试验。将一定量样液和0.1mL测试菌液均加入上层软琼脂中,需代谢活化的再加0.3~0.4mL S9mix,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照,每种处理做3个平行。试样通常设4~5个剂量。选择剂量范围开始应大些,有阳性或可疑阳性结果时,再在较窄的剂量范围内确定计量关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比为致变比(MR)。MR≥2,且有剂量反应关系,背景正常,则判为致突变阳性。
(3)试验步骤
①菌株鉴定。目前,推荐使用的菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。所有这些试验菌株都来源于鼠伤寒沙门菌LT2,都是组氨酸异养型菌株。鉴定前先进行增菌培养,为鉴定结果可靠,需同时培养野生型TⅤ菌株,作为测试菌基因型的对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃、100r/mn振荡培养基12h左右,细菌生长相为对数期末,含菌数应为1×109~2×109个/mL。
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