枝角类毒性试验方法介绍
枝角类(Cladocera)通称溞类,俗称红虫或鱼虫,它是一类与昆虫近亲的小型甲壳动物,广泛分布于自然水体中,是鱼类的天然饵料。枝角类繁殖力强,生活周期短,容易培养,因此也是一类很好的试验动物。溞类对许多毒物(特别是重金属和有机磷农药)比其他水生动物要敏感。当含有农药等有毒废水排入水体时,往往先引起类的死亡,破坏水生生态系统的平衡,从而影响鱼类的生长。因此在制定渔业水体水质标准和工业废水排放标准时,常配合鱼类毒性试验而被广泛采用。
(1)试验类及其选择用来进行毒性试验的溞应具有一定的代表性,对毒性要比较敏感,而且应来源丰富。我国有溞130多种,试验常用的有大型溞、溞状溞、隆线溞和多刺裸腹溞等,前三种都比较大,试验更为方便。
溞类的生殖方式有两种,即孤雌生殖和有性生殖。孤雌生殖产卵很多,不需要受精就能发育成个体(大多是雌体),到秋末冬初或遇到环境不良时,才能有雄体产生,然后进行有性生殖。因此,一种溞在整个生活史中会出现三种个体,即雄溞、孤雌生殖溞和有性生殖溞,它们对毒物的敏感性不同,试验时应该用纯一个体。孤雌生殖溞数量很多,一般试验均采用这种个体。另外,不同龄期的溞对毒物的敏感性不同,老年个体敏感性差,故不宜作为试验材料,试验通常采用出生后2~4d的幼溞。
(2)试验的培养和驯化 Banta(1921年)建议用马粪(风干)170g,菜园土2000g,加过滤池水10L,在室温15~18℃下经3~4d,用细筛过筛,再用过滤水稀释2~4倍,便可使用。这种培养液为 Banta液,效果很好,至今仍被采用。
试验前把怀卵的孤雌生殖溞用吸管吸出,分开饲养,经24h后,这批雌溞所产生的幼溞经吸出或用塑料纱过滤分离后,再养2~4d就可用作试验溞。
(3)试验条件 容器:溞类培养可用水族箱、搪瓷桶、陶瓷缸、玻璃缸和烧杯等容器,培养最好在恒温设备中进行,并可适当曝气。
试验用水:池水、河水、井水均可作为试验水,但必须清洁,水中悬浮物应当滤除用水一般要经活性炭过滤,必要时用紫外线消毒。用自来水时必须人工曝气或静置1~2d,去除余氯。试验水温要求在20℃左右,pH=8~9,溶解氧不能低于4mg/L,氯度(Cl-)500~2000mg/L
(4)试验步骤 枝角类毒性试验分为预备试验和正式试验两部分。
①预备试验。在做正式试验前,为了确定试验浓度范围,必须进行预备试验。预备试验的浓度范围可广些,每个浓度2~3个溞就可以。根据试验要求的时间(24或48h)找出大部分不死亡的浓度。一次找不准确,可再做二次或多次,直至找到正式试验所用浓度范围。
对于耗氧量大或变化快的试验物质,最好用流水装置进行试验。
②正式试验。选择浓度的方法与鱼类试验相同。每个浓度要有2~3个平行试验,另外设一对照。正式试验至少要重复两次。试验毒物溶液配制时,要先配成母液,再稀释至所需浓度。
用作试验的溞,先移至表面皿,在体视显微镜或放大镜下进行检查、过数,然后再移入试验液。急性试验时,用80mL小烧杯装50mL试验水,每杯放10个溞。
通过溞类毒性试验可以求得半致死浓度(LC50)或叫半忍受限(half tolerance limit,HTL),以反映污染物或有毒废水对溞类的毒性。半忍受限用在规定时间内引起溞类半数死亡的药物浓度来表示,用直线内插法求得(参考鱼类毒性试验)。死亡标准掌握的尺度直接关系到所求的数值,一般用停止活动(沉到水底不动)作为死亡的标准。
枝角类急性试验一般为48h,也有用24h或96h的,急性毒性试验一般不喂食。
5.发光细菌毒性检测
发光细菌检测法是以一种非致病的明亮发光杆菌作试验生物,以其发光强度的变化为指标,测定环境中有害有毒物质的生物毒性的方法。
细菌的发光过程是菌体内一种新陈代谢的生理过程,是呼吸链上的一个侧支,即菌体是借助活体细胞内的ATP、荧光素(FMN)和荧光素酶发光的,综合化学反应过程为:
FMNH2+2RCHO2+O2 细菌荧光酶 FMN+2RCOOH+H2+hv
该光波长在490nm左右,这种发光过程极易受到外界条件影响,凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒物质与发光菌接触时,可影响或干扰细菌的新陈代谢,从而使细菌的发光强度下降或熄灭,这种发光强度的变化,可用精密测光仪定量测定。有毒物质的种类越多,浓度越大,抑制发光的能力也越强,对于气体中的可溶性有毒物质可以通过把它吸收溶解到液体中,然后测试其对发光细菌的影响。在一定浓度范围内,有毒物质浓度与发光强度呈一定的线性关系,因此可利用发光细菌来监测环境中的有毒污染物。
目前,国内外采用的发光细菌实验有三种测定方法:①新鲜发光细菌培养测定法;②发光细菌和海藻混合测定法;③冷冻干燥发光菌粉制剂测定法。
