MALDI-TOF MS结合短期培养法快速检测中段尿样本中的病原菌
细菌性尿路感染是临床最常见的泌尿系统感染之一, 中段尿培养是诊断尿路感染的金标准, 但传统的培养鉴定方法需要2~3 d才能得出细菌鉴定及药物敏感性结果, 影响了临床的及时诊疗。近年来, 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）以敏感、快速、高效的优点而被广泛应用于临床微生物的鉴定, 显著降低了样本检测的周转时间和成本, 但MALDI-TOF MS通常需要培养出单一菌落才能进行鉴定。如何从临床样本中直接检测出病原菌是近年来国内外研究的热点问题, 但从中段尿样本中直接检测病原菌的结果并不理想。本研究采用离心方法富集细菌, 再进行短期培养, 采集菌膜后用MALDI-TOF MS直接检测, 旨在缩短常规培养时间的同时保证细菌的高检出率和细菌鉴定的正确性。
1 材料和方法
1.1 样本来源
收集2016年4— 7月复旦大学附属华东医院门诊及住院的1 873例疑似尿路感染患者的中段尿样本。
1.2 仪器与试剂
Vitek MS微生物鉴定仪及配套试剂、Vitek 2 Compact微生物鉴定仪及配套鉴定卡购自法国生物梅里埃公司, 哥伦比亚血琼脂平板、中国蓝平板购自上海科玛嘉微生物技术有限公司。质控菌株包括嗜麦芽窄食单胞菌（ATCC 17666）、产酸克雷伯菌（ATCC 700324）、铅黄肠球菌（ATCC 700327）、产单李斯特菌（ATCC BAA751）、白念珠菌（ATCC 14053）、产气肠杆菌（ATCC 13048）和光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）, 均由上海市临床检验中心提供; MS校准菌株为大肠埃希菌（ATCC 8739）, 由法国生物梅里埃公司提供。
1.3 方法
每份临床样本分为2份, 一份进行中段尿常规定量培养及鉴定, 另一份进行中段尿样本离心富集、短期培养及MALDI-TOF MS直接鉴定。以中段尿定量培养结合Vitek2 Compact微生物鉴定仪检测结果为金标准, 评估MALDI-TOF MS结合短期培养法对尿路感染病原菌鉴定的敏感性及特异性。
1.3.1 中段尿常规定量培养及鉴定 按照《全国临床检验操作规程》（第4版）[13]操作。采用定量加样枪取中段尿样本10 μ L, 接种于哥伦比亚血琼脂平板和中国蓝平板上, 5%CO2、35 ℃孵育18~24 h, 观察有无菌落生长, 并进行菌落计数。平板生长菌落数× 100即每毫升尿液的菌落数。根据菌落特点、染色和镜下形态, 并采用Vitek 2 Compact微生物鉴定仪及配套的鉴定卡进行菌种鉴定。
1.3.2 中段尿样本MALDI-TOF MS结合短期培养法检测 将样本混匀后, 取10 μ L滴到玻片上, 自然干燥后, 固定染色。油镜下观察细菌数量并进行菌落计数, 在油镜视野中见到1个细菌相当于尿液中细菌数为≥ 105 cfu/mL[13]。尿路感染患者尿样本中的细菌数通常≥ 105 cfu/mL[13], 所以本研究挑选出菌落计数≥ 105 cfu/mL的尿样本, 用定量加样枪取样本10 mL置无菌离心管中, 以3 000× g离心30 min, 弃上清液9 mL, 剩余1 mL液体及沉淀物震荡混匀后, 用定量加样枪取10 μ L接种于哥伦比亚血琼脂平板上, 5%CO2、35 ℃孵育, 分别在1、2、4、6和8 h后观察有无菌膜生长。用 1 μ L定量接种环挑取菌膜点靶, 加入1 μ L基质（α -氰基-4-羟基肉桂酸）, 干燥后放入Vitek MS微生物鉴定仪中进行细菌鉴定, 严格按照Vitek MS微生物鉴定仪操作指南操作。
2 结果
2.1 中段尿样本常规定量培养及鉴定
1 873例中段尿样本常规培养结果显示, 菌落计数≥ 105 cfu/mL的样本381例（阳性检出率为20.3%）, 其中单一细菌感染的样本346例（90.8%）, 2种细菌感染的样本27例（7.1%）, 3种及3种以上细菌感染的样本8例（2.1%）（考虑为粪便污染可能）; 菌落计数< 105 cfu/mL的样本595例（31.8%）; 无细菌感染的样本共897例（47.9%）。
2.2 中段尿样本短期培养时间与菌膜形成情况
中段尿样本离心后培养1、2、4、6和8 h, 菌膜生长（指可以采集到足够的菌量用于直接进行MALDI-TOF MS菌种鉴定）例数分别为0、0、312、371和381例; 其中2种细菌混合生长27例, 3种及3种以上细菌混合生长8例, 革兰阳性球菌均需要孵育6 h才能培养出足够菌量的菌膜进行MALDI-TOF MS检测, 见表1。短期培养1或2 h, 细菌尚未完全生长, 无法进行MALDI-TOF MS检测, 而8 h与6 h无差异, 但8 h超过了当日报告的时间, 故选择4 和6 h进行进一步研究。
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2.3 2种检测方法对单一细菌生长样本的检测
与中段尿样本常规培养法相比, 单一细菌生长的样本4 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率为80.1%（277/346）, 其中肠杆菌科细菌生长较快, 检出率高（100.0%）, 而生长较慢的非发酵菌检出率相对较低, 2株嗜麦芽窄食单胞菌未检出, 鲍曼不动杆菌检出率为93.0%, 革兰阳性球菌无明显的菌膜形成, 均未检出。6 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率为97.1%（336/346）, 明显高于4 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率, 除了屎肠球菌和粪肠球菌的检出率分别为76.9%和86.7%外, 其他细菌的检出率均达100.0%。中段尿样本短期培养后MALDI-TOF MS的检测结果与常规培养法结果相比, 除鲍曼不动杆菌（其中有8株只能鉴定到不动杆菌属）以及粪肠球菌、屎肠球菌（分别有6株和4株未形成菌膜）检出率偏低外, 其他病原菌的检出率均为100.0%。见表2。
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2.4 2种细菌混合生长的中段尿样本2种检测方法检测结果的比较
常规培养法检测出27例2种细菌混合生长的样本, MALDI-TOF MS可以鉴定出其中的优势菌（菌量较多）, 与常规培养法的检测结果完全符合。2种细菌混合生长的优势菌检测结果见表3。
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3 讨论
细菌传统的生化鉴定方法（包括血清学分型）准确、可靠, 但步骤繁琐, 检测周期较长。MALDI-TOF MS是近10年发展起来的新的微生物鉴定和分型技术, 具有样本用量少和检测快速快、稳定、重复性好的特点。目前, 国内外学者已开展了采用MALDI-TOF MS直接检测血液或其他无菌体液中病原微生物的研究。之前, 有关采用尿液MALDI-TOF MS直接检测尿样本中细菌的研究使用的是离心或洗涤富集细菌的方法, 检出率为75%~90%, 准确率为70%~91%, 检测效果不理想。
本研究改进了MALDI-TOF MS检测前的细菌富集方法。第1步, 离心, 富集细菌; 第2步, 进行短期培养, 提高细菌富集的效率。离心后取富含细菌的沉淀物接种平板, 培养1、2、4、6和8 h, 分别挑取菌膜进行MALDI-TOF MS检测。结果显示, 培养1和2 h, 尚未形成菌膜, 细菌生长的量不足以用于MALDI-TOF MS直接检测。培养4 h, 生长速度较快的肠杆菌科细菌（也是尿路感染最常见的病原菌）形成了肉眼可见的菌膜, 可挑取菌膜直接进行MALDI-TOF MS检测, 与常规培养法比较, 检出率可达到100.0%; 而非发酵菌生长速度较慢, 鲍曼不动杆菌短期培养后MALDI-TOF MS的检出率仅为93.0%, 其中8株鲍曼不动杆菌只能鉴定到不动杆菌属, 未鉴定到种; 革兰阳性球菌生长速度慢, 培养4 h尚未形成肉眼可见的菌膜, MALDI-TOF MS无法检测。培养6 h, 绝大多数革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌均可以被检出, 其余3株4 h不生长的鲍曼不动杆菌也形成菌膜并被鉴定, 但8株仅鉴定到属的鲍曼不动杆菌仍无法鉴定到种（而过夜培养后, 8株鲍曼不动杆菌均可鉴定到种）。除了屎肠球菌和粪肠球菌的检出率分别为76.9%和86.7%以外, 其他细菌的检出率均达100.0%。
排除部分粪便污染的临床样本, 尿路感染仍以单一细菌感染多见。本研究中单一细菌生长的样本占90.8%, 2种细菌生长的样本仅占7.1%。在单一细菌生长的中段尿样本中, 4 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率为80.1%（277/346）, 而6 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率为97.1%（336/346）, 明显高于4 h短期培养后MALDI-TOF MS检测的检出率, 尤其是革兰阳性球菌可以被充分检测。上午临床送检的中段尿样本, 经过6 h短期培养, 直接采集菌膜进行MALDI-TOF MS检测, 可以在当天下班前向临床发送细菌检测报告, 临床医师可以根据细菌种类的检测报告及时调整用药, 得以更加有效地控制尿路感染。虽然8 h培养细菌生长情况更佳（与6 h相比无差异）, 但下班前无法完成检测, 无法在当天出具检测报告（临床医师下班）, 不能满足临床及时更改诊断和对症治疗的需求。而对于部分生长迅速的肠杆菌科细菌, 若临床有需求, 也可在培养4 h左右、产生肉眼可见的菌膜时, 直接进行MALDI-TOF MS检测。
部分2种或多种细菌混合生长的中段尿样本, MALDI-TOF MS可以对其优势病原菌进行快速检测, 其鉴定结果与常规培养法结果符合达100.0%。而这些优势菌往往是尿路感染的病原菌。快速检测出混合感染中的优势菌, 对于明确诊断、指导用药和及时控制感染有着重要的临床意义。
本研究结果表明, 经过离心集菌后, 再进行短期培养可有效地富集细菌, 直接进行MALDI-TOF MS检测, 大大缩短了检测的时间, 同时也保证了细菌的检出率。同时, 由于分离培养纯化了细菌, 弥补了之前国内外报道的采用尿液离心、洗涤集菌后直接进行MALDI-TOF MS检测所存在的问题, 如尿液中的细菌与有形成分及蛋白混于沉淀中导致质谱信号不好, 尿液未经过培养增菌, 菌量少, 低于MALDI-TOF MS检出限而导致检测不出等。本研究采用的离心短期培养后MALDI-TOF MS直接检测的方法可使细菌检出率更高, 鉴定结果更加准确。
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