质粒DNA限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定-1
实验原理
一、DNA的限制性内切酶酶切分析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:
一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;
另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为
4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),
有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割,
产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,
如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
二、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,
还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带, 用于以后的克隆操作。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质, 其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移, 其迁移速率由下列多种因素决定:
1. DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
2. 琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,
其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb
的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%, 分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,
DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3. DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时, 它在电场中移动距离不仅和分子量有关,
还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的, 超螺旋DNA移动最快,
而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,
可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收, 用同一种限制性内切酶分别水解, 然后电泳, 如在凝胶上出现相同的DNA图谱, 则为同一种DNA。
4. 电源电压
在低电压时, 线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,
片段越大,
因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过
5v/cm。
5. 嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
6. 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动, 在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
试剂和器材
一、试剂：
l0×TBE缓冲溶液（0.89mol/L Tris–0.89 mol/L硼酸–0.025 mol/L EDTA缓冲溶液）：取
108g Tris，55g硼酸和9.3g EDTA（EDTANa2 · 2H20）溶于水，定容至1 000mL，调pH 8.3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。
6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml, 用铝箔或黑纸包裹容器, 储于室温即可。
二、 材料
λDNA: 购买或自行提取纯化；
重组pUC19质粒；
