m6A甲基化的疑难杂症与治疗方法(二)
三、p-9005检测的疑难杂症和药方
1.病症一:样本
对于这个试剂盒,很多人对与样本方面有很多的疑问,虽然试剂说明书上说可适用任何物种的m6A检测,但是同学们还是有各种各样的问题:
(1)RNA样本类型
处方:培养的细胞,新鲜和冷冻的组织,石蜡包埋的组织,血液,体验等等样本的总RNA,mRNA,tRNA,rRNA和snRNA均可适用该试剂盒。
(2)RNA样本提取方式
处方:市面上销售的试剂盒提取的均可,Trizol法可能是可以的,但是Trizol法提取的请确保提取后将RNA重新溶解在不含RNase的水中或合适的缓冲液(例如TE)中,并且RNA质量高且相对不含DNA。
(3)RNA样本符合要求的标准
处方:OD 260/280 >1.9。260/230 > 1.7 【无DNA污染】
2.病症二: 对照
关于试剂盒中的对照方面,也是有很多同学问询。
(1)阳性对照怎么设置
对于第一次上手做这个实验的同学们或许都会有些疑惑,阳性对照难道不都是要做标准曲线的吗?不然怎么对照和计算呢?
处方:其实,这个试剂盒是可以根据实验需要进行选择做单点对照(0.5ng/ml)还是做标准曲线(0.02~1ng/ml)。建议做复孔哟。
(2)阳性对照信号太弱
处方:【1】添加至孔中的PC量不足,确保加入足够量的PC;【2】标准液未进行最佳稀释,并充分混合;【3】确保PC的保存方式是按照说明书进行保存的,一定要保存在指定条件下哟,【4】在使用的时候,要注意稀释后放置在冰上,保证有效成分不被讲解。
(3)阴性对照背景值太高
处方:【1】可能没有洗干净,按照说明书进行清洗;【2】被PC或者样本污染了,切记要换枪头加样;【3】孵育时间太长,按照说明书进行操作1~10min,最长也不能超过2h;【4】显色时间过长,可适当缩减显色时间。
(4)样本值太低或者没信号
处方:
【1】可能是因为没有加入足够量的RNA。厂家推荐的样本输入量为100ng~300ng,200ng为最佳,但是这又不是绝对的噢,同学们可根据自己的样本做相应的调整尤其在信号偏弱的情况下,可适当上调RNA的输入量。
【2】可能是因为产品本身m6A的含量就很低。
【3】可能是样本的纯度不够,有DNA或者其他的污染,或者RNA发生了降解,这些都可能造成低信号。
【4】mRNA样本的话,可能因为片段太小(<80 nts),也会导致低信号。
3.病症三:数据分析
(1)如何计算标曲
处方:线性回归,二阶多项式,四参数对数回归都可以。
(2)不同输入量检测出来的数据是否可一同进行数据分析?
处方:是可以的,但是要注意计算的时候要以不同的数据进行。比如你第一次的样本输入量是200ng,计算公式带入的值为200;第二次样本输入量是300ng,计算公式带入的值必须为300.
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