几种多聚螯合物酶法
实验概要
本文介绍了三种多聚螯合物酶法：PowerVision法，ELPS法和EPOS法。
实验原理
1. PowerVision系统的原理是连接抗体上紧密地连接上许许多多的酶分子，呈串珠状排列，由于利用了一种小的呈线性或很小枝状多功能试剂作为骨架分子，与酶和免疫球蛋白交联，排列紧密，形成串珠状多聚物，因此相对分子质量较小。其特点是简便、敏感。其操作流程同EnVision法，但一抗的稀释度可在EnVision法基础上作进一步。
2. EnVision法又称为ELPS法(enhance labeled polymer system)，抗原—抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物(葡聚糖)酶复合物(EnVision复合物)，与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。EnVision复合物是利用一种多聚化合物将HRP或AKP和第二抗体(抗鼠或抗兔IgG)同时标记在一个多聚化合物上，即形成酶—多聚化合物—第二抗体巨大复合物。每1个分子的复合物中约含10个分子的HRP和10个分子的第二抗体，复合物中的HRP的绝对数量远高于其他复合物(如ABC)，本身已具备高度放大作用，因此EnVision法敏感性显著高于其他方法。复合物中存在多个第二抗体，也增加了该复合物与特异性抗体的结合机会。同时，人体内不存在该多聚化合物，无非特异性干扰，故背景染色浅。此外，染色步骤为两步，且第二抗体孵育时较短，使该方法更省时而简便。
3. EPOS法原理是采用一种具有惰性的多聚化合物(葡聚糖)为骨架，将特异性抗体和HRP结合在一起，形成HRP-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物，该复合物内不含第二抗体及亲和素。染色时，只需在组织切片上加入相应的酶标记特异性抗在组织切片上加入相应的酶标记特异性抗体EPOS试剂，孵育30～60min即可完成。勿需再加酶标记第二抗体。
实验步骤
1. PowerVision法
1) 4um常规石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3minX3次。
2) 预处理组织切片(可用酶消化或AR或不作任何处理，依一抗质量而定)。
3) PBS洗3minx3次。
4) 0.3％H2O2阻断内源性过氧化物酶15min，PBS洗3minX 3次。
5) 适当稀释特异性一抗，室温孵育1h，PBS洗3minX3次。
6) 滴加山羊抗小鼠(或兔)IgG-HRP多聚物(PowerVision)，室温孵育30min，PBS洗3minX3次。
7) 0.04％DAB-0.03％H2O2显色8-12min。
8) 水洗后，苏木精衬染1～3min，水洗蓝化5～10min，盐酸乙醇分化5s，水洗5min，系列乙醇脱水，常规树胶封片。
9) 观察结果。
2. EnVision法
1) 4um常规石蜡切片经烤片后，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，PBS洗3minX3次。
2) 预处理组织切片(可用酶消化或AR或不作任何处理，依一抗质量而定)。
3) PBS洗3minX3次。
4) 0.3％H2O2阻断内源性过氧化物酶15min，PBS洗3minX 3次。
5) 适当稀释特异性一抗，37℃孵育几，PBS洗3minX3次。
6) EnVision复合物(即用型)孵育30min，PBS洗3minx3次。
7) 水洗，复染，常规树胶封片。
8) 结果观察。
3. EPOS法
1) 4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3minX3次。
2) 蛋白酶消化或抗原修复(AR)，PBS洗3minX3次。
3) 0.3％过氧过氢(H2O2)处理5min。
4) 蒸馏水洗，置于PBS中洗5min。
5) 加入相应的DakoEPOS／HRP试剂，室温孵育30～60min。
6) PBS洗3minX3次。
7) 0.04％DAB-0．03％H2O2显色8～12min。
8) 水洗，复染，常规树胶封片。
EPOS法只需1次孵育，是目前最简便的方法。其特异性较高，基本无背景染色，敏感性虽然不如其他二步多聚螯合物方法，但符合一般工作需要。EPOS法不足之处是现有商品化的酶标记特异性抗体的品种不全，目前只有20余种。此外，试剂价格昂贵，尚不能广泛推广应用。
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