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荧光原位杂交（FISH）技术的应用与实验流程

2020.4.15

分子诊断是诊断市场增长最快的部分。萤光原位杂交和FISH分析包括700万人口的5亿美元的市场。。FISH市场预计为11％，较去年同期成长为下一个五年。400至500万人口的市场，在美国产生。FISH测试是用来识别生物标记DNA / RNA的形式。它是用于遗传作图和基因表达分析公知的方法。这种技术使用荧光染料标记的探针，并映射到一个染色体或帧内核DNA，以产生在原位通过显微镜观察荧光信号的核苷酸序列。它是如细胞离心涂片（细胞悬浮液），然后触摸用制剂或福尔马林固定的新鲜制剂进行的，也可以使用石蜡包埋的（FFPE）组织中。它主要用于以下领域研究和临床诊断:
•产前诊断
•癌症诊断
•出生缺陷的分子细胞遗传学和精神发育迟滞
•染色体异常
•临床遗传学
•神经科学
•生殖医学
•毒理学
•微生物生态学
•进化生物学
•比较基因组学
•细胞基因组学
•区分良性和恶性肿瘤
这个市场的多数是试剂包括FDA批准测试,伴随诊断,研究仅使用探测器,定制试剂探针和支持和供应。有必要进行杂交执行这些劳动密集型的测试设备。理解需要杂交过程设备要求必须清晰地定义。
必要的设备如下:
——酸度计
——天平
——搅拌盘
——微离心机
——冰箱
——冷冻
组织准备要求:
——切片机
——水浴
——原位杂交箱
执行FISH过程将需要下列设备和材料除了试剂:
——载玻片干燥机
——水浴
——原位杂交炉
——Coplin罐
——盖玻片
——染色皿
——橡胶胶水(可选:取决于设备使用)
——荧光显微镜DAPI过滤器(蓝色),FITC过滤器(绿色),德州红色过滤器摄影的能力
FISH的过程——简化
样品准备——depariffinization、脱水、空气干燥,预处理(95 C @ 30分钟,Coplin Jar),蛋白酶治疗(37°C 10 - 20分钟,Coplin Jar),脱水,空气干燥,马克,适用FISH类探测器,
用水泥覆盖玻璃
变性 - 5分钟@ 75°C（45 - 50℃，中期扩展+额外的步骤，以变性探针）杂交 - 37℃，16小时 - 72小时
贴标过程
直接标记 - 标签结合到探针和它是较不敏感的
间接标记 - 检测之前附加步骤，用抗体，结果放大单检测探头
存储 - 4 - 8°C长达两个月的时间，在黑暗区域 - 感光
关键的流程步骤
在FISH的过程分为两个步骤需要的设备用于加热的幻灯片;所述变性步骤和杂交。这些步骤是最FFPE FISH程序相似。
变性：变性的探针和双链DNA
平均时间：5分钟
标准温度：75℃
杂交：探针杂交到靶核酸
时间范围：16 - 72小时
标准温度：37℃
已经孵育好的幻灯片必须储存在4 - 8°C,直到他们在显微镜下进行拍摄。他们可以在这些温度储存数月之久。