使用UPLC/MS/MS分析血清中的25-羟基维生素D（一）
简介
临床研究表明：维生素D缺乏症在世界许多地区的成人和儿童中非常普遍。除了众所周知的影响(例如与钙吸收障碍相关的佝偻病、骨质疏松症和骨软化症)外，现在越来越多的证据表明维生素D缺乏症还会增加罹患某些癌症的风险，并对许多其它疾病有一定的影响1,2。维生素D具有两种存在形式，一种是皮肤暴露于日光下所产生的维生素D3(D3) ，另一种则是存在于多种补品中的植物衍生物—维生素D2(D2)。维生素D在肝脏中代谢形成25-羟基维生素D[25OHD]，后者在肾脏中进一步代谢形成活性代谢物1,25-二羟基维生素D。25OHD的水平被认为是评价体内维生素D水平的最佳临床指标3。维生素D水平的评估对于维生素D缺乏症的诊断和补充治疗的监测非常重要。最近，相对于竞争性结合检测、免疫检测和HPLC法等其它方法，利用LC/MS/MS方法定量分析25OHD2和25OHD3在提高检测质量和降低成本方面，更加受到人们的青睐。免疫检测的主要问题是无法区分25OHD2和25OHD3，还需依靠抗体与25OHD2的交叉反应才能测定25OHD的总浓度
。如果该交叉反应低于100%，那么D2治疗可能无法得到准确监测4。
图1. 沃特世ACQUITY UPLC/TQD的系统配置
实验
将Waters® ACQUITY® 串联四极杆检测器(TQD)与ACQUITY UPLC®联用以进行各项分析。完整的系统配置如图1所示。仪器通过MassLynx® 4.1软件在电喷雾正离子模式下运行，并采用QuanLynxTM应用软件自动进行数据处理。对锥孔电压进行优化，使得进入离子源的母离子的丰度最大化，并通过第一级四极杆选择相应的母离子进入碰撞池。利用氩气和碰撞能量促使碰撞诱导解离，生成特征性产物离子。利用此方法建立特异的多重反应监测(MRM) ，实验如表1所示。
LC条件
LC系统： Waters ACQUITY UPLC系统
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C8, 2.1 x 50mm, 1.7μm
柱温： 45 ˚C
流速： 400μL/min
流动相A： 2 mM醋酸铵+0.1%甲酸的水溶液
流动相B： 2 mM醋酸铵+0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度： 流动相B在73%保持2 min，在1.5 min内从73%增加至98%
MS条件
MS系统： Waters ACQUITY TQD
电离模式： ESI+
毛细管电压： 2.5kV
锥孔电压： 24V
脱溶剂气温度：400˚C
脱溶剂气流量：900L/h
源温度： 120˚C
碰撞气流速: 7.10 x 10-3mbar
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综述
