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使用UPLC/MS/MS分析血清中的25-羟基维生素D（三）

2020.6.22

精度
通过提取低、中和高浓度的QC样品并重复分析5次以测定批内精度。根据这三个浓度水平计算25OHD的变异系数(CV) 。对低、中和高浓度的QC样品进行连续5天的分析，测定批间精度。结果如表2所示。

灵敏度
提取所得的最低浓度内部血清校准品的色谱图如图5所示。各色谱图标记了化合物名称、峰间信噪比(SNR)和浓度。所有响应均高于检测限(SNR 5:1)，因此，本方法可检出维生素D严重缺乏症患者的维生素D水平(<6ng/mL)。

图5 .色谱图显示了最低浓度校准品和各个分析物的信噪比测定结果。

离子抑制
离子抑制研究表明25OHD3在离子抑制区域部分洗脱，如图6所示。

图6 .25OHD离子抑制分析，通过放大视图显示了25OHD2和25OHD3的洗脱分析结果。

需使用一种稳定同位素标记内标物来补偿所观测到的各个分析物之间的基质效应差异⁵ 。

讨论
本文中开发了一种利用UPLC/MS/MS分析血清中25OHD2和25OHD3的方法。该方法通过从血清中进行液-液萃取以及利用定性和定量离子进行各个分析物定量检测。此外，通过监测定性离子比率提高了准确识别分析物的可靠性。测定结果表明，本方法具有良好的灵敏度以及批内和批间精密度。采用本方法，可以每天分析多达100个样品。

结论
本文中开发的分析血清中25OHD2和25OHD3的方法具有良好的线性、灵敏度和精度。本方法与传统的免疫测定法相比，可提供更加可靠的结果。

UPLC/MS/MS能够准确可靠地测定血清中的250HD2和250HD3，防止误报接受D2补充治疗的患者体内的维生素D总体浓度。

参考文献
1. Gorham ED, Garland CF, Garland FC, Grant WB, Mohr SB, Lipkin M, et al. Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta-analysis. Am J Prev Med 2007;32:210–6.
2. Garland CF, Gorham ED, Mohr SB, Grant WB, Giovannucci EL, Lipkin M, et al. Vitamin D and prevention of breast cancer: pooled analysis. J Steroid Biochem Mol Biol 2007;103:708–11.
3. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes Institute of Medicine. DRI Dietary Reference Intakes for calcium phosphorus, magnesium, vitamin D and fluoride. National Academy Press,Washington,DC; 1997.
4. Hollis B. Editorial: The Determination of Circulating 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. J Clin Endocrinol Metab, July 2004,89(7):3149–3151.
5. Viswanathan CT. et al. Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. Pharmaceutical Research 2007;24(10):1962-1973.

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周锦帆