不得了，大牛告诉你lncRNA甲基化如何研究
lncRNA分子通过海绵机制结合microRNA发挥生物学功能，这个ceRNA机制已经让大家心生厌倦了。可大牛就是大牛，引入甲基化就能轻松的变废为宝，竟然能让lncRNA的ceRNA思路变得瞬间高大上发表10分以上的文章，你一定和小编我一样很好奇他是怎么做到的。
RNA甲基化，作为最新的国自然热点受到了越来越多的关注，更多的研究开始着重RNA甲基化方向的讨论与研究，仅仅在刚刚过去的两个月当中，10+的RNA甲基化文章就多达16篇。2018年国自然立项情况来看RNA甲基化中标数目是2017年的4倍之多，其中不少项目开始从mRNA转为关注非编码RNA的甲基化对于疾病发生发展过程重要作用的研究，例如m6A甲基化lncRNAs在套细胞淋巴瘤中的作用与机制研究（北京大学），RNA去甲基化酶FTO介导的lncRNA-m6A修饰对肝癌细胞重编程的调控作用及机制研究（同济大学）等等。云序生物以同济大学康九红团队于2018年2月发表在Nucleic Acid Research（影响因子11.561）为例给大家讲讲，lncRNA分子发生甲基化该如何研究。
1. linc1281对于mESC（小鼠胚胎干细胞）分化必不可少
研究表明主要分布在细胞质当中的linc1281对于mESCs细胞的分化是不可或缺的，shRNA方法沉默内源表达的linc1281使细胞展现正常的自我更新特征，但mESCs特征性的基因Oct4、Sox2和Nanog表达没有改变，暗示linc1281可能和其他生物学功能相关。研究者将lincRNA沉默的细胞注射至免疫缺陷的小鼠当中，相比于对照组，linc1281沉默的小鼠畸胎瘤生长在体积和重量方面明显小于对照组肿瘤。HE染色以及免疫组织化学结果表明linc1281分子的沉默可以有效的阻滞mESCs的分化过程。此外在体外研究mESCs细胞分为中胚层源心肌细胞和外胚层源神经细胞系的能力时发现linc1281对多能性相关marker表达无显著影响，而使mESCs分化能力显著减弱。另一方面对linc1281的过表达可以增强mESCs的分化能力。
2. 深入研究的linc1281发生m6A甲基化修饰
最近的研究表明m6A RNA甲基化修饰能够影响mESCs的细胞命运，很多mESCs特异的转录本都会受到m6A修饰，那么自然而然产生疑问，前期已经深入研究的linc1281会不会有m6A甲基化修饰？对mESCs如此重要的lincRNA分子是否也受到m6A甲基化调控？MeRIP-qPCR实验证实linc1281确实发生甲基化修饰，并且shRNA沉默下调RNA甲基化酶Mettl3使得linc1281的甲基化水平下降，证明Mettl3是调控linc1281的RNA甲基化酶
3. linc1281甲基化水平和该分子的生物学功能呈正相关
Linc1281长1306nt，整个序列当中有3个m6A motif RRACU，通过构建motif点突变、缺失突变质粒转染至HEK293FT细胞当中对外源性的linc1281进行过表达。实验结果证明linc1281 motif的突变使得linc1281甲基化水平显著降低。在linc1281缺失的细胞中过表达野生型linc1281、突变缺失m6A的linc1281、m6A修饰的NC突变体等，RT-PCR表明突变缺失m6A的细胞株在心肌细胞趋势方面并不显著，相反有m6A修饰的linc1281过表达的细胞株分化程度最为显著，并且sh1281+linc1281的质粒能够明显促进神经分化，由此可以看到linc1281甲基化水平和mESCs的分化程度呈正相关。细胞回补实验证明只有在m6A motif 完整的linc1281过表达条件下能够恢复linc1281敲除细胞系的干细胞分化能力。得出结论linc1281的m6A修饰水平和干细胞分化能力直接相关。
4. linc1281甲基化能够影响该分子的ceRNA模型
既然linc1281的m6A甲基化没有影响到linc1281的表达量，那么m6A甲基化如何影响到该分子的生物学功能呢？通过软件预测和细胞定位实验发现let-7家族和linc1281相互结合且均在胞浆当中丰度较高，荧光素酶报告实验通过将linc1281全长和micorRNA mimics共转发现，仅有microRNA mimcs可以降低linc1281的荧光强度，相反如果对linc1281与microRNA结合区域进行突变使两者不发生结合，此时microRNA mimics并不能显著降低linc1281的荧光强度，结合let-7表达量和linc1281呈负相关，证明let-7家族和lin1281确实发生直接结合。结合之前构建的质粒sh1281+linc1281、sh1281点突变等发现，对m6A motif的点突变处理后，let-7表达量无显著变化，相反linc1281质粒当中let-7表达显著下调，也就意味着m6A修饰影响到linc1281和let-7家族microRNA的结合，即m6A甲基化修饰影响到了该非编码RNA分子的ceRNA模型。作者进一步通过对METTL3的沉默、突变处理和相关细胞回补实验进一步证实，linc1281的m6A修饰确实能够影响到linc1281和microRNA的相互结合。这一点合理的解释了m6A在不影响到表达水平的情况下如何影响生物学功能的问题。
总结：
在RNA甲基化研究领域当中，对于mRNA的甲基化研究目前最多，而对于非编码部分（lncRNA、circRNA、pri-miRNA等）的甲基化研究相对较少，相对而言非编码的RNA的甲基化研究可以说更为时髦。云序生物公众号之前已经对非编码RNA发生RNA甲基化研究文章进行汇总整理（插入之前的公众号链接），我们将RNA甲基化的适用人群做了两类划分：1科研人员过去已经对某些mRNA，lncRNA，circRNA有一定的研究基础，可以考虑引入RNA甲基化，检测是否有发生RNA甲基化修饰并且该修饰是否能直接和细胞表型相关联，发表一篇高质量的RNA甲基化文章。2没有前期基础数据的科研人员也可以同时展开对RNA甲基化的检测以及转录组测序（mRNA测序，lncRNA测序，环状RNA测序），迅速选定发生RNA甲基化并且转录组水平发生改变的基因，寻求两组学之间的关系，还可以增加RNA甲基化上游一些相关酶的研究（甲基化酶，去甲基化酶等）。
重点：云序生物全面的RNA甲基化测序服务是您的优质选择，非编码RNA和编码RNA分子的甲基化测序、3种RNA甲基化修饰（m6A，m5C，m1A），应有尽有，想发高分文章吗？还在等什么？
RNA甲基化高分文章罗列
RNA
年份\杂志
内容
影响因子
全文链接
mRNA
2017 Nature
m6A调控免疫T细胞分化及稳态
40.58
[1]
mRNA
2017 Cell
m6A介导哺乳动物皮质神经发育
31.40
[2]
mRNA
2018 Cell
R-2HG通过靶向FTO/m6A/MYC/CEBPA信号通路发挥抗肿瘤活性
31.40
[3]
circRNA
2017 Cell Research
m6A调控circRNA编码蛋白质
15.40
[4]
circRNA
2017 Cell reports
circRNA整体m6A甲基化谱
8.23
[5]
lncRNA
2015 Nature
LncRNA(MALAT1)的m6A调控pre-mRNA合成
40.58
[6]
lncRNA
2017 Cancer Cell
m6A甲基化调控LncRNA FOXM1-AS促进癌细胞增殖
27.41
[7]
lncRNA
2018 Nucleic Acids Research
m6A甲基化调控lncRNA 1281影响小鼠胚胎干细胞分化
10.16
[8]
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