用核酸内切酶构建亚克隆
实验概要
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
主要试剂
1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，高压灭菌20min。
2．1.5%琼脂LB固体培养基： 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶，加100ml LB，高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
实验步骤
1、目的DNA片段和载体的制备
选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述）
2、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接
（一）外源DNA片段末端不同性质的连接要求：
性质不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率，载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端：线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理，载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中率，载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端：线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理，载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
平端：要求高浓度的DNA和连接酶，载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
（1）.连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
（2）．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
（3）. 轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
（4）．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。
注意事项
1.目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。
2.不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。
3.连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。
4.制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。
5.白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的
片段需通过鉴定。
