放线菌素D诱导HL-60细胞凋亡的观察实验_凝胶电泳法
| 实验方法原理 | 放线菌素D（actinomycin D）是抗肿瘤类抗生素，其主要作用是通过与DNA 结合，阻断依赖DNA 的mRNA 的合成，从而阻碍蛋白质合成，抑制瘤细胞分裂，引起细胞凋亡。细胞凋亡时，其核染色质的DNA 出现缺口甚至断裂，致使染色质凝聚、边缘化甚至呈现DNA 碎片。利用与DNA 结合的荧光染料染色后，在荧光显微镜下即可观察到上述变化。Hoechst33258 为与A-T 结合的特异性DNA 染料，对活细胞和固定细胞均能染色。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 放线菌素D琼脂糖TAE异丙醇乙醇DNA提纯试剂盒DNA marker溴化乙锭6×loading buffer 染液染液工作液甲醇PBS液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、细胞基因组DNA 提取 1. 药物处理：取处于对数生长期的HL-60 细胞（5×105 个/ml）加入放线菌素D 至终浓度5 ug/ml，37 ℃孵育20 小时。
2. 收集细胞：4 ℃，1500×g，离心5min，弃上清。 3. 清洗细胞：加入600 ulPBS 重悬细胞，1500×g，离心5 min，弃上清。 4. 加入600 ul Nuclei lysis solution，来回吸打数次。 5. 加入3 ul RNAase solution，颠倒离心管5 次，混合样品。 6. 37 ℃，水浴30 min，室温静置5 min。 7. 加入200 ul protein precipitation solution，涡振20 sec，置冰中5 min。
8. 4 ℃，13000×g 离心5min。小心吸上清于另一离心管中。 9. 向上清液中加入600 ul 异丙醇，颠倒混合。4 ℃，13000×g,离心5 min。弃上清，收集沉淀DNA。
10. 加入600 ul 70％乙醇，颠倒数次，清洗DNA。4 ℃，13000×g,离心2 min。小心弃上清，室温干燥沉淀10-15 min。
11. 加入10 ul DNA rehydration solution，65 ℃，水浴30-60 min，并定期轻柔振荡离心管使沉淀溶解。
12. 溶解液（即DNA 提取样品）4 ℃保存备用。
1. 灌制琼脂糖凝胶 （1）备好注胶槽，插上梳子。称1 g 琼脂糖，加100 ml TAE，微波炉加热溶解。
（2）向胶槽中注入温热的1％琼脂糖胶，胶层厚度约3-5 mm。 （3）室温静置30-45 min，使琼脂糖胶完全凝结。小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，使梳孔端靠近阴极（黑色）。
（4）向电泳槽中加入TAE，让液面刚好没过凝胶约1 mm。
（1）在蜡膜上分别加3滴6×loading buffer，每滴2 ul。 （2）从4 ℃冰箱中取出制备好的未经放线菌素D 和经放线菌素D 处理的DNA 样品各10 ul，加入到loading buffer 中。在余下的一滴loading buffer 中加5 ul DNA marker 和5ul 灭菌去离子水，反复吸打，充分混合。
（3）用加样器分别把上述样品缓慢加至琼脂糖凝胶的加样孔中。 （4）盖上电泳槽盖，接好电极插头，打开电源，电压调至100-110 V，电泳45-60 min。
（5）将电压调至零，关电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。 3. 染色观察 （1）取出凝胶，放入含有EB（0.5 ug/ml）的溶液中，室温浸染20 min。 （2）于暗室中，在紫外灯下进行观察。 （3）染色结果：经放线菌素D 处理的细胞在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状DNA 区带图谱（DNA ladder），这是细胞凋亡的重要生化特征。而未经处理的细胞则没有DNA 凋亡所特有的梯形条带。DNA 断裂情况可与对照比较，断裂程度用DNAmarker 所显条带度量。
1. 收集凋亡细胞悬液于1.5 ml 离心管中，4 ℃，500 rpm，离心5 min。 2. 弃上清，将细胞重悬于PBS 液中，制成细胞悬液。 3. 取100 ml 细胞悬液，涂于载玻片上，晾干。 4. 用甲醇固定1 min,充分晾干。 5. 滴加Giemsa 染液（工作液浓度），室温染色5 min。 6. 用流水轻轻洗去染液，室温晾干。 7. 用二甲苯浸泡3 min，去除杂质，待载片透明后，以树脂封片。 8. 普通纤维镜下观察。 9. 结果观察：Giemsa 染色的标本，细胞核红紫色，细胞质蓝色，凋亡细胞的核染色质固缩边集，染色较深或核破裂；细胞膜皱褶、卷曲，或出泡芽生，形成凋亡小体。
1. 培养细胞，诱导凋亡（在超净台进行）。 2. 收集细胞：1000 g/min 离心5 min，其上清。 3. PBS（37 ℃）漂洗悬浮细胞。 4. 固定液（4 ℃）固定5 min,500~1000 g/min 离心5 min，弃上清。 5. 蒸馏水洗，500~1000 g/min 离心5 min，弃上清。 6. 调整细胞数至0.5~0.2×106/ml。 7. 取100 μl 细胞悬液，加入1 μl Hoechst 33258 染液，染色10 min。 8. 将10 μl 染色的悬浮细胞涂于载玻片，加盖玻片。 9. 放于荧光显微镜下观察。选用UV 激发滤片和400-500 nm 阻断滤片。 10. 结果观察：细胞核呈蓝色。凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化，或玻 珠化，并可呈现DNA 荧光碎片。 展开 |
| 注意事项 | 1. 对大片段DNA 不能振荡，应轻轻反复翻动离心管，以免机械剪切力损伤DNA 链。 2. 收集沉淀DNA（特别是凋亡细胞的DNA）时需格外小心； 3. 样品加入样孔的位置应该合适； 4. 溴化乙锭为较强的致突变剂，应带乳胶手套操作； 5. 紫外光能损伤眼睛，不要直视光源； 6. 污染物须放入专用容器内，妥善处理。 7. Hoechst33258 染液应4 ℃避光保存。 展 |
