质粒DNA的制备和纯化
实验概要
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松弛控制型（高拷贝）。 从细菌分离质粒DNA的方法都包含3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸纳（SDS）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链不会分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
主要试剂
SDS 溶菌酶 酚 氯仿 无水乙醇 葡萄糖 EDTA 乙酸钾 NaOH Tris碱 STET STE等
溶液I： 50mmol/L 葡萄糖溶液 25mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10mmol/L EDTA (pH8.0)
溶液II：0.2mol/L NaOH, 1%SDS
溶液III：5mol/L的乙酸钾
实验步骤
（一）细菌培养和收集
将含有质粒的Ecoli菌种接种在LB固体培养基（含50 μg/ml Amp）中，37oC培养12~24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含50μg/ml Amp）中，37 oC振荡培养约12小时至对数生长后期。
（二）质粒DNA的少量快速提取（碱法）
1． 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，4 oC下12000g离心30s，弃上清，倒置片刻，使液体流尽。
2． 菌体沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡使菌体充分重悬，加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，立即将离心管缓慢颠倒数次直到溶液变清亮，冰浴5min。
3． 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，缓缓颠倒离心管数次直到白色沉淀充分形成，冰浴5min，离心5分钟
4． 上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1 :1），震荡混匀，4 oC下12000g离心5分钟。
5． 将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后置于-20 oC冰箱中20分钟，然后4oC下12000g离心5分钟。
6． 弃上清液，将管口敞开倒置于卫生纸上，使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇液沉淀一次，4 oC下12000g离心5~10分钟。
7． 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
8． 将沉淀溶于20μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/ml RNaseA）中，储于-20oC冰箱中。
（三）纯化：Wizard少量 DNA 纯化系统
Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。
该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。
2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
3、加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。
4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。
5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。
6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。
10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。
11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
注意事项
1.提取过程尽量保持低温。
2.采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。
3.沉淀DNA通常用冰乙醇，低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
4.树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。
5.在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。
6.纯化树脂必须混匀后再用.
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