痘苗病毒储液制备
实验方法原理
实验材料 悬浮培养的 HeLa S3 细胞痘苗病毒
试剂、试剂盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶
仪器、耗材 Sorvall H-6000A 转子150 cm2 组织培养瓶CO2 培养箱
实验步骤
1. 用血细胞计数器对悬浮培养的 HeLa S3 细胞进行细胞计数。
2. 将 5×105 个细胞室温 1800 g，离心 5 min，弃上清。
3. 将细胞悬浮于 25 ml 37℃ 完全 MEM-10 培养基中，放入 150 cm2 组织培养瓶中，将其放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。同样，也可使用 150 cm2 组织培养瓶中贴壁培养的单层细胞（见「细胞培养实验」基本方案 1），直接进行步骤 4。
4. 在使用前，将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合，涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min， 并在保温过程中每隔 5～10 min 涡旋混匀一次。
病毒储液的滴度常常在 2×109 pfu/ml 左右，但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。
如果经过涡旋混匀后，还可以看见团状物，将其冷却到 0℃ 并在冰上超声波作用 30 s。此步骤可重复多次，但在两次超声波作用之间，样品一定要置于冰上冷却。
5. 用完全 MEM-2.5 培养基将胰酶作用后的病毒稀释到（2.5～7.5）×107 pfu/ml。吸出 150 cm2 组织培养瓶中的培养基，加入 2 ml 稀释的、胰酶作用后的病毒。放入 CO2 培养箱中 37℃ 培养 2 h， 每隔 30 min 用手轻轻摇动培养瓶。
6. 加入 25 ml 完全 MEM-2.5 培养基覆盖细胞，放入 CO2 培养箱，37℃ 培养 3 天。
7. 将培养瓶中被感染的细胞转移到无菌的塑料管中，在 5～10℃，1800 g 离心 5 min，弃上清。
8. 将细胞用 2 ml 完全 MEM-2.5 培养基重悬（每 150 cm2 组织培养瓶），用吸管轻轻吹吸或涡旋混匀。
9. 用反复冻融的方法裂解细胞悬液：用干冰/乙醇冷冻细胞，37℃ 水浴及涡旋解冻，如此进行 3 次。
10. 将病毒储液放置在冰上，并将其独立分装成小份，每份 0.5～2 ml，放入 -70℃ 保存。
注意事项
每孔中有 20～80 个噬斑一般可以取得较好的结果，在测定滴度时，可以考虑用胰酶对病毒储液进行 1:1 稀释。
