杆状病毒储液制备实验
基本方案 从悬浮培养中制备
基本方案 从单层培养中制备
噬斑试验测定滴度
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 悬浮培养的 Sf 9 细胞 待接种的杆状病毒（野生型的或重组） |
| 试剂、试剂盒 | 含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH |
| 仪器、耗材 | 150 mm 培养瓶 27℃ 培养箱 倒置显微镜 带有 GH-3.7 水平转子的4℃GPR离心机 带螺口盖的冻存管 液氮罐 500 ml 旋转细胞培养瓶 多转瓶的揽拌台 |
| 实验步骤 |
1. 用 50 ml TNM-FH /10％ FBS 培养液在 500 ml 旋转培养瓶中培养 Sf 9 细胞，直到细胞密度达到约 1 × 105 细胞/ml（见昆虫细胞保存培养实验）。 2. 室温下以 1000 g 离心 10 min 回收细胞，弃去上清。加入 10～20 ml 新鲜的 TNM- FH/10％ FBS 培养液重悬细胞团块。加入感染复数（MOI）为 0.1～0.5 的病毒接种（见步骤 1.2）。 MOI 以 pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI （pfu/细胞）× [细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）] 3. 将细胞重新放入旋转培养瓶中，用 TNM-FH/10％ FBS 培养液将体积加至 100 ml。27℃ 置搅拌台上以 60～80 r/min 恒速搅动，培养 3～4 天。周期性地取少量悬浮培养细胞在显微镜下观察细胞病变效应及包含体。 4. 当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常是感染 4～5 天后），将细胞培养液移入灭菌试管中，4℃ 以 1000 g 离心 10 min， 将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取 1 ml 上清移至几个螺口冻存管中，置液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处 4℃ 短期保存。
展开 |
| 注意事项 |
病毒储液也可以由悬浮生长的昆虫细胞（Sf 9、Sf 21 和 HighFive）制备：用无血清或无蛋白质的昆虫培养基来培养昆虫细胞，在 100 ml 或 500 ml (只加至 250 ml）的旋转培养瓶中，直到细胞密度达到（1～2）×106 细胞/ml。病毒应以 0.1～0.5 的感染复数直接加到悬浮培养液中，培养细胞 4～5 天，按步骤 2.4 收获病毒。 |
