荧光免疫技术显微镜检查过程及注意事项
标本经荧光抗体染色后,需要在荧光显微镜下观察。荧光显微镜是免疫荧光化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成,是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
在荧光显微镜检查时,首先要选择好的光源或滤光片,滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。激发滤光片的作用是提供合适的激发光。根据光源和荧光色素的特点,可选用以下三类激发滤板,提供一定波长范围的激发光。
紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过;
紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300～450nm范围内的光通过;
紫蓝光激发滤板:它可使350～490nm的光通过;最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用蓝绿滤板激发。
荧光显微镜检查的注意事项:
①应在暗室中进行检查,进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5～15min,待光源发出的强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本;
②防止紫外光对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;
③检查时间每次以1～2h为宜,超过90min,超高压汞灯的发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外光照射3～5min后,荧光也明显减弱;所以,最多不得超过2～3h;
④荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源,天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源;
⑤标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发;
⑥荧光亮度的判断标准:一般分为四级,即“一”——无或可见微弱荧光,“+”——仅能见明确可见的荧光,“++”——可见有明亮的荧光,“+++”——可见耀眼的荧光。
