DNA的测序技术-2
一:仪器:
离心机,PCR仪,高压电泳仪, 测序槽 ,摇床 ,染色,脱色缸
易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
二:试剂:
测序反应试剂 ,硝酸银,硫代硫酸钠,碳酸钠,37%甲醛,冰乙酸,乙醇,硅化及反硅化试剂
固定/终止液:10%冰乙酸
染色液:混合2g硝酸银,3ml 37%的甲醛于2l超纯水中
显影液:在2l超纯水中溶解60g碳酸钠,冷却至10-12℃,临用前再加入3ml 37%甲醛,400μl 硫代硫酸钠(10mg/ml)。现配现用。
三:操作
(一):测序反应操作
1:标记4个0,5ml的微量离心管(G.A.T.C),每管加入2μl相应的d/ddNTP混合物,盖上盖子,保存于4℃或冰浴备用。
2:另外准备离心管按下表分别加入各种试液
任意模板平端 克窿到PGEM载体多克窿位点区的DNA
5×测序缓冲液 5μl 5×测序缓冲液 5μl
模板DNA fmol-pmol PGEMDNA(4μg) 4μl
特异性引物(4.5pmol) 3.6ul pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6μl
加水到终体积 16μl 加水到终体积 16μl
3:在上述2的模板/引物混合物中加入1μl测序级Taq酶(5μ/μl),用移液器抽吸几次混匀。
4:从上述3中吸取4μl分别加入1中准备好的四组d/ddNTP混合液的离心管中。
5:在台式离心机中离心,使各试剂混合并沉降于管底。
6:在每管中加入一滴矿物油。
7:PCR反应,具体参数如下
95℃预变性 2min 95℃(变性) 45秒 42℃(退火) 45秒 70℃(延伸) 60秒 60循环 70℃(延伸) 10min(注意:反应参数随PCR仪不同、引物不同有较大变化)
8:PCR结束后,在每管中加入3μl DNA测序中止液(在加入中止液前,样品允许在4℃保存过夜),在台式离心机中离心,以中止反应。样品于-20℃保存。