DNA测序技术的基本内容

2021.12.03

　　(一)

　　测序模板制备

　　测序模板应为单一来源DNA，包含质粒DNA、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增产物回收的DNA等。测序模板制备过程中应防止外源DNA污染，避免外部因素对测序模板的破坏和降解。

　　1.质粒DNA的制备

　　样品经平板培养挑取用质粒转化的单菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，振荡培养获得细菌培养物，分离质粒DNA作为测序模板。

　　通常釆用十二烷基硫酸钠(SDS)碱裂解法从细菌培养物中分离质粒DNAO采用电泳或限制性核酸内切酶消化的方法对所获得的质粒DNA进行完整性鉴定，一般通过260nm波长处的吸光度值(A260)、260nm与280nm波长处的吸光度比值(A260/A280)分别检测质粒DNA的浓度和纯度。

　　2.PCR扩増产物DNA的制备

　　样品经DNA提取、PCR扩增和产物回收后，制备的目的DNA片段作为测序反应的模板。

　　在DNA提取前，动植物类中药材需采用适宜的方式去除外源污染；动物源性原材料与辅料的取样应有代表性，固体样品应研磨至细粉，液体样品应充分混匀；微生物、生物制品生产检定用菌毒株和动物细胞基质需获得纯培养株。在DNA提取过程中需针对不同样品采用相应的提取方法，所获得的DNA应具有合适的浓度、纯度和完整度。DNA提取效果依据不同样品类型来确定，一般通过A260、A260/A280分别检测DNA的浓度和纯度。

　　提取的DNA经PCR扩增达到指数级倍增，退火温度、最佳循环数可根据检测要求和检测对象确定。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯或蓝光（一般用470nm波长）照射下迅速切取目的条带所在位置的凝胶块，采用PCR产物凝胶回收试剂盒进行回收。PCR产物也可不经琼脂糖凝胶电泳，直接采用PCR产物纯化试剂盒进行回收。回收的PCR扩增产物DNA一般通过A260、A260/A280对其浓度和纯度分别进行检查。

　　（二）DNA测序

　　制备的测序模板经测序反应和产物纯化后获得不同长度的寡核苷酸，进行自动化测序。

　　1.测序反应和产物纯化

　　测序反应为单链模板的线性扩增，即在测序反应体系中只加入一条测序引物。反应体系包含缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、荧光标记的ddNTPs、测序引物、测序模板和灭菌的纯化水。测序引物由测序模板的来源信息确定。

　　根据目标序列的长度选择合适的测序反应程序，并采用适宜方法对测序反应的产物进行纯化，通常采用乙醇醋酸钠法，获得不同长度的荧光标记寡核苷酸。

　　2.上机测序

　　将不同长度的荧光标记寡核苷酸加入上样板，根据所使用的荧光标记方法、毛细管长度和电泳胶的种类选择相应的运行和分析模式，不同长度的荧光标记寡核苷酸由小到大依次通过检测窗口，激光器发出激光并激发ddNTPs上的荧光标记，电荷耦合元件图像传感器（charge-coupled device，CCD）记录荧光信号，根据荧光信号识别为对应的碱基和质量值（Q值），获得DNA测序峰图（trace file）。

　　（三）结果分析

　　1.测序峰图质量评估

　　基于碱基Q值对测序峰图的质量进行评估，依据供试品类型确定测序峰图的质量要求，对于质粒DNA测序峰图，去除引物后峰图的平均Q值需大于30，Q值小于20的碱基数占总碱基数的百分比需小于1%；对于PCR产物测序峰图，除满足上述要求外，还需去除两端低质量序列，且剩余测序峰图的长度需大于PCR产物长度的50%。不合格的测序峰图不能用于序列拼接和结果判定。

　　2.序列拼接

　　双向测序峰图使用相应的软件进行序列拼接，正反向测序峰图的重叠区域（overlap）需大于目的DNA序列长度的50%，不一致碱基（替代、插入或缺失）的确定依据Q值的高低，但占总碱基数的比例需小于1%。

　　3.拼接结果质量评估

　　依据供试品的类型和结果判定标准，对拼接获得的一致性序列（consensus sequence）进行质量评估，一致性序列不合格的不能用于结果判定。

　　（四）结果判定

　　将获得的DNA序列与标准核酸序列数据库的标准核酸序列（标准核酸序列的建立参照9109标准核酸序列建立指导原则）进行比对。判定标准为：对于动植物来源供试品，测序结果与标准核酸序列的差异应控制在物种的种内差异水平；对于微生物来源的供试品，测序结果与标准核酸序列的差异应控制在适宜的菌株鉴定水平；对于生物制品生产检定用菌毒株和动物细胞基质等供试品，其核心序列应与标准核酸序列完全一致或核心序列所编码的氨基酸序列应与标准核酸序列所编码的氨基酸序列完全一致。

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周锦帆