质谱沙龙第三十六期活动报道
首都医科大学附属北京朝阳医院药事部 李鹏飞
北京朝阳医院药事部李鹏飞老师分享了WHO生物分析方法学的相关内容。李鹏飞老师去年和今年参加了WHO有关生物分析的两次培训会。李老师将两次培训的内容总结与大家分享。
分析方法学的全面确认
包括五个方面的内容：选择性、残留效应、定量下限、标准曲线、准确性。
选择性
要求有六个来源的空白基质，并且空白基质中的响应小于定量下限(LLOQ)的20%，才能认为空白里是没有基质干扰的，否则空白是不合格的。比如做方法学验证时，三条曲线三个空白，可能第二个空白会有小峰，WHO的规定是小峰的面积不能超过定量下限峰面积的五分之一。还提到了代谢物、降解产物和联合给药可能产生的干扰。
残留效应
对于残留效应，国内做的比较少，首先保证它不会影响准确性和精密度，先注射高浓度的样本，再注射空白溶液，空白样本出峰要求<20% LLOQ、<5% IS。
如果无法避免，则应采取具体的应对措施。样本分析中还要避免随机化。
定量下限
检测方法能够定量的最小药物浓度必须小于给药后达到的最大浓度的10%，即定量下限(LOQ)小于1/10Cmax。WHO对生物等效性要求较松。
校准曲线
与实际样本相同的基质，每个分析批一条标准曲线，确认三条标准曲线。在研究阶段，应在预期浓度范围内进行，建议至少应在浓度范围内选择五个(EMA的规定为六个)浓度进行试验(不包括空白和零点)，大于75%的曲线上点合格。必须提交相关系数，回归y截距和斜率。对于校准品相对回归曲线的偏差，应进行分析，以便评估其线性。反向计算浓度的准确度小于15%(LLOQ除外：<20%)。建议在确认过程中使用最新的校准曲线。
准确性
应在掺加已知量分析物的样本中来评估准确性/精密度，使用至少3个浓度水平(低、中、高)的结果来评估准确性/精密度。准确性应报告为加样回收率。精密度为变异系数(标准差/平均值)。
BE研究生物分析分析方法的验证
局部验证
如果已验过的分析方法有了轻微的变化，包括生物分析方法转移到另一个实验室，设备、校准浓度范围、储存条件等的变化。重新验证或部分验证的范围应该是合理的，在大多数情况下，就修改问题而言，应提供足够的附加精确度和精密度数据和相关稳定性的数据。
交叉验证
如果数据是从不同的研究基地取得的，则应当对所采用的分析方法进行检查验证。例如，样品制备的差异，或使用另一种分析方法。应该在分析研究样品前进行，同组QC样品应以两种分析方法进行分析，两次测量之间的差异不应超过15%。
临床样本分析的要求
临床样本分析应在开始采集临床样本之前，对分析方法进行确认。每个分析运行应包含充足的QC样本，此类样本应处于开始、中间和结果等至少3个水平(LQC、MQC和HQC)。在实际开始对临床样本进行分析之前，应预先确定批次的接受和拒绝标准。
最后来自AB SCIEX公司的李春波博士为大家带来了题为“SWATH技术与TripleTOF平台”的精彩报告。
SWATH技术
SWATH技术是AB SCIEX与Prof.Ruide Aebersold及其团队共同开发的，该技术为蛋白质组学研究带来了一种全新的工作流程。SWATH技术将扫描范围划分为25Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息，是MS/MSALL技术的扩展。SWATH技术通过TripleTOF 5600平台实现，可同时提供完整的定量与定性结果，不需要进行方法优化，获得所有化合物的信息，可以对所有化合物进行查询，高分辨率的定量结果减少了潜在的干扰物，定量能力达到三重四极杆质谱的水平。
李春波博士以地图全貌的方式，来形象地比较SWATH与MRMHR采集模式的不同。MRMHR采集虽然很精细，但却无法让我们看到整个全部的图；而用SWATH采集，首先可以看到全貌图，然后可以找出和MRMHR采集同样的详细图谱。SWATH的采集方法得益于AB SCIEX TripleTOFTM技术的超高采集速率和高分辨、高质量准确度；在一次分析中，可鉴定和定量样品中的几乎所有肽段和蛋白质。
MRM、MRMHR以及SWATH间对比图
TripleTOFTM 5600/+系统应用于蛋白质组学
(1)具有高灵敏度的特点，更多低丰度的蛋白质能被检测和鉴定出来；
(2)SmartSpeedTM 100Hz谱图采集频率。定性时，单位时间内，相比任何质谱，IDA更多时间用在MS/MS上，保证质谱对复杂样品的挖掘深度，提高对复杂样品检测的实际灵敏度，从而鉴定到更多的蛋白质。定量时，不论MS或者MS/MS，都能获得更多的数据点，使得定量数据更可靠；
(3)高分辨率(>40,000)，无论是低分子量区和高分子量区，还是低扫描速度和高扫描速度下，都能达到高分辨率，满足蛋白质组学中对分辩率的绝大多数要求，对从头测序、iTRAQ提供最好的支持；
(4)EasyMassTM质量准确度(<1ppm)，MS和MS/MS都能达到，提供更可信的蛋白质鉴定系统；
(5)定量线性动态范围>4个数量级，是所有高分辨率质谱中定量能力最强的。
TripleTOFTM 4600
TripleTOFTM 4600 在2012年全球首发于北京，是高性价比质谱平台，用于常规性/定量分析，以无与伦比的高采集速度，获得高灵敏度、高分辨率、高准确度的一级和二级质谱数据。
(1)具有AB SCIEX公司优势的离子源和通路设计，其一级MS和二级MS/MS均具有超高灵敏度；
(2)具有高分辨率：在TOF MS和MS/MS扫描模式下>25,000；
(3)快速数据采集：高达100 Hz的采集速度，或在IDA(智能实时数据过滤)模式下每秒采集多达50张二级MS/MS 谱图；
(4)具备高质量准确度，和简洁质量校正能力，在分析检测复杂蛋白质组时<1ppm RMS；
(5)宽动态范围确保出色的定量性能，线性动态范围高达4个数量级。
(6)TripleTOFTM 4600系统也具有三种工作模式，分别为定量分析模式、定性分析模式、全景分析模式，具备同时定性和定量的完美性能。该系统最大的亮点是它可以在一次运行中鉴定更多的蛋白，并将这些信息转化为靶蛋白质组学分析，重新分析样品而无需切换平台。使用4600系统，研究人员将大大简化他们的工作流程，因为对大量生物样本的定性和定量分析实验可以再同一系统上完成。
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TripleTOF™ 4600：高通量精确质量定性定量的主力机型
AB SCIEX Triple TOF™ 5600新产品发布会在京隆重举行
