质粒DNA的提取
实验概要
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。
实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
主要试剂
1． 溶液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0)
10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）
[0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后调pH值至8.0] （灭菌）。
[1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL浓HCl，充分溶解后调pH值至8.0]（灭菌）
2． 溶液 Ⅱ
0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）
3． 溶液 Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4. TE 缓冲液
10 mmol/L Tris.HCl
1 mmol/L EDTA(pH 8.0)
5. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）
6. RNase
将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。
7. LB Amp100培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。
主要设备
恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。
实验步骤
（一）细菌的培养
将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37℃培养过夜）
（二）质粒提取
1. 将2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。
2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。
3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5 min。
5. 加200 uL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5 min 。
6. 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min 。
7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。
8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。
9. 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min。12000r/min离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10. 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11. 加入适量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。
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