推开GPCR靶点与代谢性疾病研究的敲门砖-动物模型
基因编辑技术最具代表性的就是在人类疾病动物模型制备方面的应用。随着经济发展，代谢性疾病的发病率逐年增高，其中心血管疾病导致的死亡占我国居民全部死因的40%以上，死亡率居于首位[1]。通过构建包括心血管疾病、糖尿病等代谢领域基因编辑小鼠模型，并进行多种深入研究，可以找到相关疾病的潜在治疗靶点，研究靶点作用机制，推进药物研发领域的发展。
G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，作为最大的药物靶标蛋白家族，家族成员800多个且分布广泛，与多种疾病的发生和进展过程有所关联。GPCR药物研发具有非常重要的价值，靶向GPCR靶点药物总计475种获批，涵盖108个GPCR靶点，开发创新的药物变得的愈发重要[2]。GPCR家族的基因编辑动物模型研究也为开发创新靶点药物提供了契机。本篇内容小编为大家分享GCPR靶点基因敲除小鼠在部分代谢疾病研究中的应用。
图1. G蛋白偶联受体信号通路[3]
GPCR靶点基因编辑小鼠模型与代谢疾病相关研究
心血管疾病
动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种复杂的慢性炎症疾病，是大多数心血管疾病 (Cardiovascular diseases, CVD) 的根本原因，它的炎症过程由免疫细胞网络及其随后的反应所促进。细胞网络由多种炎症介质协调，它们相互作用、结合并诱导信号传导。GPCRs 成为识别这些介质的重要参与者，由于其介导的功能效应种类繁多而成为有前景的药理学靶点，它们与许多在动脉粥样硬化发展中起关键作用的过程有关。Chemerin受体23（ChemR23，也称为CMKLR1）是一种表达在免疫细胞亚型（如树突状细胞、巨噬细胞等）表面的A类GPCR蛋白。ChemR23可维持M1巨噬细胞表型，刺激pDC迁移和浸润动脉粥样硬化斑块（图2）。
图2. 各种 GPCR 参与动脉粥样硬化发展的示意图[4]
近期有研究采用Apoe-/-ChemR23-/-小鼠模型进一步证明Erv1/Chemr23 的靶向缺失与巨噬细胞中促动脉粥样硬化信号、氧化低密度脂蛋白摄取增加、吞噬作用减少以及动脉粥样硬化斑块大小和坏死核心形成增加相关。表明ChemR23具有一定的抗动脉粥样硬化作用（图3）[5]。
图3. Apoe-/-xErv1/ChemR23-/-小鼠增强动脉粥样硬化，促进斑块成分和基因表达的改变
与心血管疾病相关的GPCR成员主要分布于A类家族的α亚类，如人体最重要的神经体液调节系统之一，血管紧张素系统（RAAS）中的AT1R、AT2R以及Mas-R。血管紧张素II（AngII）1 型受体（AT1R）可自发激活。通过膜环境、相互作用蛋白、受体自身抗体和单核苷酸多态性（SNP）等增加AT1R表达的途径，可以在 AngII 缺失的情况下，增加G蛋白信号[6]。
Yasuda[7]等人首次证明野生型hAT1R表达的心脏特异性上调会导致自发性收缩功能障碍和心腔扩张，并伴随遗传性血管紧张素原（Agt）缺陷小鼠的严重间质纤维化，通常认为 AngII 与 hAT1R 结合可启动信号转导通路。为了阐明AngII非依赖性AT1R激活在心脏中的致病作用，将在α-肌球蛋白重链 (MHC) 启动子控制下过表达hAT1R的转基因小鼠与Agt敲除小鼠杂交，建立 AT1Tg-AgtKO 杂交小鼠，其中AngII的产生存在遗传缺陷。在AT1Tg 亲代小鼠中，hAT1R 的过度表达在内源性 AngII 水平存在的情况下可诱导心脏重塑。具有内源性 AT1R 表达水平的 Agt 缺陷小鼠未出现病理学变化。当 AngII 生成受到基因抑制时，由于天然 hAT1R 的过表达，体内组成性活性的增强可能导致心脏异常[8]。
在各种激素、细胞因子、炎症或代谢应激下，心脏和血管中AT1R的上调将成比例地增强 AT1R 的组成活性，并加速这些组织中的疾病发展。
图4. 组成性活性 AT1R 信号转导机制[6]
目前研究人员已经发现多种疾病基础上的GPCR突变，并开发了表达这些突变的转基因小鼠及相关GPCR的基因编辑小鼠作为人类疾病的动物模型，证实了GPCR 家族为心血管疾病的治疗提供了新的视角。
2型糖尿病
2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种复杂的多基因疾病，其病人存在着明显的胰岛素抵抗，胰岛素信号转导缺陷是产生胰岛素抵抗的重要机理，同时也影响胰岛素的分泌。随着基因技术的快速发展，利用基因敲除技术探其在产生胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷中的作用已成为该领域的研究热点[9]。
图5. GLP-1的生理作用[10]
人胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1受体，GLP-1R）是GPCR家族B类家族的一员，分布于产生胰岛素的胰腺细胞表面，GLP-1与其结合后激活腺苷酸环化酶产生cAMP，同时增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌。GLP-1促进β细胞胰岛素分泌可通过两种方式，其一是通过蛋白激酶A(PKA)信号途径磷酸化分泌颗粒相关蛋白质，以促进Ca2+依赖的胰岛素胞外分泌；另一作用是通过鸟嘌呤核苷酸交换因子(cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor)介导[11]。
图6. GLP-1促进胰岛素分泌的机制[11]
GLP-1通过GLP-1R发挥作用，它可刺激胰腺产生胰岛素并抑制胰高糖素的分泌，从而发挥其对胰岛β细胞的增殖及抗凋亡作用，可通过减缓胃排空速度调节血糖以保持动态平衡。研究表明GLP-1R敲除小鼠可免受高脂饮食诱导的胰岛素抵抗，抑制胰高血糖素分泌和延迟胃排空，从而减少餐后血糖波动[12]。此外还有研究表明GLP-1与骨代谢也有密不可分的联系，可通过降钙素依赖途径抑制破骨细胞，增加骨量，GLP-1R在成骨细胞前体表达，GLP-1R基因敲除小鼠还可引起骨质疏松症。因此，糖尿病与骨代谢具有一定的相关性[13]。
GLP-1的发现及功能研究为糖尿病治疗药物的开发提供了新的策略，目前已有几类靶向于GLP1R的多肽类药物已获批用于2型糖尿病的治疗，包括Exenatide、Liraglutide、Lixisenatide、Albiglutide及Dulaglutide等[14]。口服型靶向GLP1R的多肽药物和小分子药物正处于临床试验中。
小结
基因编辑技术的发展和动物模型的开发，为代谢等领域疾病的早期发现及治疗提供了强有力的手段，充分利用这些技术将进一步的研究疾病潜在的治疗靶点与进展。
虽然目前仅有2例靶向GPCR的单克隆抗体获得FDA批准，但研究热度依然不减。GPCR家族蛋白成员具有7次跨膜，以及其天然的低表达率的特点使得可溶性GPCR抗原难以制备，抗体筛选困难。针对这类靶点采用基因敲除的全人抗体小鼠（RenMab+KO）进行抗体筛选，利用细胞系或多肽环作为抗原，将大大提高抗体筛选效率，推进药物开发进展。
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