血液分析仪综述(二)
3、激光散射和细胞化学染色技术
最早采用该技术的是Technicon 公司的H1,H3 型，现在的最新型为西门子公司的Advia120 型和2120 型（2007
年以前为Bayer
公司产品）。它是一款开发比较早的高等级仪器，其在白细胞分类上采用了过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。在红细胞和血小板分析都采用了双角度激光法。在仪器的管路、电磁阀门、反应杯上采用了独特设计的集成液流版管路系统，是目前血细胞分析仪中所独有和特有的技术。集成液流板实际上是将各种管路和电磁阀门、反应杯等血球计数仪的常用硬件进行综合处理，系统化，微小化，透明化和集成化。形成的集成板被放置在仪器的明显部位，方便观察，并具一定的美观效果。其另一特点则是细小的管路和反应杯可是标本和试剂用量明显减少。
在白细胞分类上，该仪器采用两个通道进行，一个为过氧化酶检测通道，另一个为嗜碱细胞检测通道。过氧化酶反应（peroxidase，POX）是血涂片染色的一个常用细胞化学染色方法，用于鉴别原始细胞与成熟的粒细胞，鉴别粒细胞与非粒细胞。染色后的细胞内无蓝黑色颗粒出现为阴性反应，出现细小颗粒或稀疏样分布的黑色颗粒为弱阳性反应，出现黑色粗大而密集的颗粒为强阳性反应。过氧化物酶主要存在于粒细胞系和单核细胞系中，各类白细胞对过氧化物酶的反应是这样的：早期的原始粒细胞为阴性，早幼粒以后的各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟过氧化酶含量逐渐增强，中性分叶核粒细胞会出现强阳性反应，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶反应，嗜碱粒细胞不含此酶呈阴性反应。在单核细胞系统，除早期原始阶段外，幼稚单核和单核细胞会出现较弱的过氧化物酶反应。淋巴细胞、幼稚红细胞、巨核细胞等都为过氧化物酶阴性反应。Advia 120/2120 血细胞分析仪的过氧化酶（Perox）检测通道就是根据这个原理设计的，它检测每一个通过流动计数池中的白细胞，经过激光照射所产生的过氧化酶散射光吸收率，来当然试剂和辅助试剂均进行了改良。
在Perox 通道所产生的散点图，横轴表示在5°-15°激光散射获得的细胞过氧化物酶含量情况，纵轴是低角度散射光测量的细胞体积大小。在此通道内细胞被分为五类。1）过氧化酶最强阳性的嗜酸性粒细胞；2）过氧化酶强阳性的嗜中性分叶核粒细胞；3）体积较大、过氧化酶弱阳性的单核细胞；4）体积较小、过氧化物酶阴性的淋巴细胞；5)体积大于淋巴细胞且过氧化物酶阴性的未染色大细胞，此类细胞增加提示幼稚或原始的各类细胞可能出现。在嗜碱细胞（BASO）通道中采用的检测原理是：专用的嗜碱性粒细胞试剂（BASO）将除了嗜碱性粒细胞以外的白细胞除去细胞膜，使其裸核化并体积变小，仅将嗜碱性粒细胞保持原有状态，体积明显大于其他类的白细胞。在散点图上处于上面区域的为嗜碱性粒细胞；散点图的横坐标可表示细胞核结构的复杂性，处于左侧的为单个核的细胞群，包括单核细胞和淋巴细胞；处于右侧的为分叶核细胞；中间部位则考虑为杆状核细胞；左下端为单个核的原始细胞区。
该仪器在红细胞、血小板的测定上也采用了光学检测技术。通过激光照射扫描每个通过Flowcell 的红细胞，低角度散射光（2 °~3 °）用于测量细胞体积；高角度(5°～15°)散射光测量每个红细胞内的血红蛋白浓度（CH）和血红蛋白含量平均值CHCM。这两个值不受红细胞数量和血红蛋白测定的影响。还可根据每个红细胞内血红蛋白浓度，计算出红细胞内血红蛋白分布宽度（HDW）值。其根据红细胞在体积大小和单个红细胞内血红蛋白含量的分析，将红细胞划分为9 个区域，得到红细胞体积和色素含量分布的九分图，也是该仪器在红细胞分析方面独有的特色，根据红细胞分布情况可初步判断疾病类别。在血小板计数分析上也同样采用了二维光散射分析法，即可获得血小板体积大小，可测量1~60fl 内的各种大小不同的血小板，还可对血小板内容物含量（MPC）进行测定。血红蛋白测定采用连续流动比色法和红细胞散射光直接测定法两种方法，有助于高脂血和高胆红素血标本的血红蛋白测定准确性。
4、双鞘流技术和细胞化学染色法
ABX 是法国生产血液分析仪的著名厂家，其生产的全自动血液分析仪Pentra 120
型为其高端产品。在白细胞分类上采用该公司特有的ZL技术-双鞘流（DHSS）分析法。双鞘流是ZL技术，而测定本身是通过电阻抗和光吸收法双重原理。标本首先在第一鞘流液中经过电阻抗测定分析，得到细胞体积测定结果，然后通过第二鞘流引导再行光吸收率分析，对细胞内容物进行测定，最终将细胞测定信息在散射图相应的位置表现出来。双鞘流技术的核心部件是含有红宝石小孔的复杂的鞘流池，在双鞘流系统的上下两端分别加上恒定电流，是保证电阻法的测量要素。为了保证被检测的细胞能够正确通过计数孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行矫正，因此通过左侧鞘流泵注入稀释液形成第一鞘流液，其作用是保护溶液能够直接通过计数小孔，并且保证其中携带的细胞处于中心部位，液流不发生偏移和扭曲；溶液通过计数小孔后，再通过中间鞘流泵注入稀释液形成第二股鞘流，用以保证吸光度测量。这样的过程被称为双鞘流分析技术。
仪器通过两个通道来完成白细胞的五项分类。其采用的细胞化学染色技术（Cytochemistry）的原理是经典的细胞分类技术，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料（Chlorazol Black E）。在仪器的LMNE 检测池中，全血样品与染色剂充分混匀，在35℃条件下进行孵育，此过程的作用是：①溶解红细胞②对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）也进行不同程度的着色③固定细胞的形态，使其保持自然状态。由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同、每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光率。
染色后的标本被引导进入鞘流池进行双鞘流分析，首先经过60mm 红宝石小孔进行电阻法分析，用于判断细胞体积大小，在LMNE 散点图上的横坐标即可表示出细胞大小的特性。然后样本迅速进入直径为42mm 的第二鞘流检测通道进行光吸收率测定，以判断细胞形态和内容物等情况。根据每类细胞在这两个分析参数上所表现出来的特性，形成二维分布的散点图。在此通道内可完成白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞群的分类。此通道内在分析的同时还能够检测两群异常白细胞亚群：巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值，异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值，同时还可提供多达82 种提示和报警信息。
在LMNE 散点图上，各类白细胞的特点是：①淋巴细胞：典型的淋巴细胞体积较小、形态规则、胞浆内没有颗粒，其吸光率最低，所以定位在散点图的右下部矩阵中，正常淋巴细胞散点图为正态体积分布。②单核细胞：典型的单核细胞体积较大、肾状核、胞浆内有初级颗粒（几乎不着色），细胞核大且不分叶，光散射较少，所以位于吸光率轴的最下端，依据单核细胞的体积，位于体积轴的最右端，而异常单核细胞及特大单核细胞则可能出现在LIC 的矩阵中。③中性粒细胞：典型的中性粒细胞具有嗜中性颗粒及分叶核的结构，中性颗粒部分着色，同时由于颗粒及核的分叶等形态上的复杂性，而产生光散射。所以中性粒细胞群散点图位于中部。核分叶越多的中性粒细胞，吸光性越强，在散点图上的位置向右移。同时杆状细胞（Bands）体积与中性粒细胞接近，但核的复杂程度低，吸光率低，散点图位于中性粒细胞与单核细胞之间。④嗜酸性粒细胞：由于嗜酸性粒细胞含有特异性颗粒，与染色液特异性着色，其着色强度最深，位于Y-轴的最上端，此方法提高了嗜酸性粒细胞的分类的准确性。⑤巨大未成熟细胞（Large Immature Cell）：未成熟粒细胞因其体积较大，可含有颗粒，光散射强，位于嗜中性粒细胞散点图的右侧，在LIC 矩阵图中从左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒细胞，另外各种原始细胞位于单核细胞的右侧区域中。由于此散点图中可能有大单核细胞，可引起LIC 假性计数增加（LIC 的计数结果被计算到在嗜中性粒细胞中）。LIC 包括：大单核细胞、高嗜碱性的单核细胞、巨大中性粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、原始细胞。⑥异型淋巴细胞(Atypical Lymphs)：在散点图中位于淋巴细胞与单核细胞之间的一群细胞，包括：小原始粒细胞、大淋巴细胞等。
在WBC/BASO 检测池中，全血样品与BasolyseII（PH2.4）溶血剂混合，在35°C 恒温下，溶解红细胞，由于嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能够保持形态完整，而其他白细胞胞浆溢出，成为裸核状态。细胞通过一个直径为80mm 的鞘流微孔时，根据电阻抗原理进行测定，以细胞体积大小为横坐标绘制WBC/BASO 直方图。依据阈值设定区分裸核化的白细胞与嗜碱性粒细胞。在直方图上可以看出在中心界标左侧的是细胞体积变小的其它细胞群，界标右侧是体积较大的嗜碱性粒细胞。因嗜碱性粒细胞数量极少，因此在直方图上基本见不到明显分布曲线和峰。
红细胞和血小板仍然采用电阻抗原理测定，血红蛋白采用比色法。此为在软件系统中采用了浮动界标技术用于血小板计数及嗜碱细胞计数，直方图的界标会依据细胞群的变化做出相应的自动调整。血小板计数上还采用了防返流装置，目的为防止涡流现象对血小板计数产生影响。在白细胞计数过程中还采用了白细胞平衡检测原理（WBC Count Balance），使得白细胞计数在WBC/HGB 通道中与LMNE 双鞘流池计数结果相联系，如果出现较大差别则可进行报警提示。最近该厂推出新一代ABX Pentra DX120 型血细胞分析仪，其测定原理仍然采用双鞘流技术。采用新技术扩展了散点图分布范围，形成可对血液中未成熟的粒细胞、单核细胞和淋巴细胞共20 个参数的分类或提示性报告信息，这对异常血细胞的筛检提供了很大帮助。
5、多角度偏振光激光散射技术
美国雅培公司（ABBOTT）推出的血液分析仪，在白细胞分类中采用独特的多角度偏振光散射（MAPSS）技术，其所生产的血细胞计数仪从CELL-DYN
3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（蓝宝石），在白细胞分类上均采用了MAPSS
技术。该技术基本原理是细胞在激光束的照射下，在多个角度都产生散射光，仪器在四个角度的四个检测器将接收到的相应的散射光信号，然后经过微处理器分析处理，将各类细胞安置在散点图上的相应位置，并计算出白细胞分类结果。
多角度偏振光散射白细胞分类技术（ Multi—Angle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞颗粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透压高于鞘液渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时的红细胞折光指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。在鞘流系统的作用下，样本被集中为一个直径30μm 的小股液流，该液流将稀释的血细胞单个排列，然后通过激光束，激光照射于细胞上，在各个方向都有其散射光出现。0°为前向角散射（1°～3°）光，可粗略地测定细胞大小；②10°为狭角散射光（7°～11°），可测细胞结构及其复杂性的相对特征；③90°为消偏振光散射（70°`～110°），基于颗粒可以将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。④90°垂直光散射（70°～110°），主要对细胞内部颗粒和细胞成分进行测量。这四个角度同时对单个白细胞进行测量和分析后，即可将白细胞划分为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5 种。ABBOTT 的五分类法定量很有意思，不用传统的体积定量，而是采用数量定量，每次计数时完成10000 个细胞测定即停止。
该类型仪器除了基本的白细胞五分类外，还提供了其它异常白细胞的信息和报警，提供给检验者参考，以通过人工显微镜检查复核这些结果，例如异常
淋巴细胞、原始细胞、未成熟粒细胞、杆状核中性粒细胞。国内桂林优利特公司生产的URIT系列五分类血细胞分析仪，采用相同的分类技术，经过多年的发展，在市场上得到了用户的好评，并荣获2013年国家高性能医学诊疗设备重大专项奖。
6、激光散射技术
日本光电公司是开发和生产五分类血细胞分析仪的厂家之一，目前所知仅有两款类型的仪器投入市场，均采用相同的测定原理，型号是MEK-7222K和MEK-8222K。其WBC、RBC
和PLT
计数原理采用电阻法，白细胞分类测定采用鞘流技术和激光散射原理。在鞘流液中白细胞通过管路进入鞘流池内，激光照射白细胞后发生的各种散射光，根据血细胞的体积、血细胞的复杂性（有无颗粒、核的构造等）的不同，散射光的强度和方向有所不同。激光直进方向和同方向小角度的散射光（表示Size）、激光直进方向和同方向大角度的散射光（表示Complexity）、与激光直进方向相对垂直的方向的散射光（表示Granularity）为参数的作为散点图，对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞进行分类。Size
表示血细胞的大小、Complexity 表示白细胞结构的复杂度、Granularity
表示白细胞颗粒的程度。采用此原理可提供了三个散射图，MAIN 散点图、NE-EO 散点图和MO-BA 散点图。在MAIN
散点图上（大图部分）下面散点表示淋巴细胞群，右侧为粒细胞群；两个小图，NE-EO 为中性粒细胞和嗜酸性粒细胞散点图，MO-BA
为单核细胞和嗜碱性粒细胞细胞散点图。此外仪器还能给出大的不成熟细胞（LIC）提示信息。
7、迈瑞激光散射和细胞化学染色技术
迈瑞（MINDRAY）公司是国内最早有能力生产五分类血细胞分析仪的厂家，他们目前生产的五分类血细胞分析仪、BC-5800
检测速度快：全自动进样90个样本/小时，开放进样80个样本/小时型自动五分类血液细胞分析仪，采用半导体激光散射技术和细胞化学染色技术，配合改良的流式分析装置对白细胞进行精确的五分类分析。BC-6900
检测速度：最高125 个标本/
小时为目前最高配置，可选择使用静脉血或预稀释末梢血，均能获得良好的各种细胞计数结果和白细胞五分类结果。具有血液和体液检测功能，有六个通道、九种模式。
鞘流技术是所有高档血细胞分析仪均采用的细胞进样技术，为了达到更高的液流速度压力差和更稳定的液体流动，该公司独创性地采用了二次加速鞘流技术，分级实现鞘液的第二次加速，增加了单位时间内细胞的通过流量，从而能够完成对预稀释血液进行白细胞五分类分析。
仪器通过两个通道完成白细胞分类测定。在DIFF 通道中增加了利用了可对嗜酸性粒细胞进行染色的特殊试剂。激光散射分析技术是五分类法常用的分析技术，由于细胞的物理特性，当激光照射到细胞时，会有不同角度的散射光出现。低角度(1°~5°)散射光可反映细胞体积大小信息；中高角度(10°~20°)散射光可反映细胞颗粒的复杂性信息。综合这两个角度散射光的信息，结合其他特殊技术来完成白细胞的五分类测定。标本在鞘流的带动下进入仪器的检测区域后，激光照射于细胞之上所发射出的低角度和中高角度散射光信号可表现出细胞大小和内容物复杂程度（包括细胞内颗粒等）的特性信息，经仪器检测分析，将其分布在一个二维空间的散点图中，可区分淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。而化学染色技术可进一步实现对嗜酸性粒细胞的准确判定。
在WBC/BASO 通道中通过强溶型试剂和特异性染色技术，可保留完整的嗜碱性粒细胞，并对其进行特异性修饰，同时破坏其它四类白细胞，使之形成膜包核状态，在激光的照射下同样形成两个角度的散射光，完整的嗜碱性粒细胞体积偏大，其他类别白细胞体积变小，通过激光信号的强弱来计数嗜碱性粒细胞并在该通道中计数白细胞总数。该方法可以有效排除难溶性红细胞、巨大血小板、血小板聚集及其它非细胞颗粒等因素对计数的影响，保证嗜碱性粒细胞及WBC 总数的精确分类和计数。
第五节核酸荧光染色技术在血液分析仪的最新应用
一、概述
目前，五分类血液分析仪已经为许多大中型医院实验室所使用。五分类仪器不同于三分类仪器的主要区别在于：为了精确定量地检测白细胞的五种成份，各种五分类血液分析仪开始采用多种物理学原理（电阻抗、光散射、高频波技术），甚至设置专用检测通道和化学染色方法检测数目最少的嗜酸、嗜碱性粒细胞。
而高档次的五分类血液分析仪，除了检测正常白细胞五项分类以外，还致力于高灵敏地检测幼稚、异常成份。对于外周血中的幼稚成份，过去一般依赖于显微镜镜检。而普通血液分析仪对异常标本报警的灵敏度有限，常常造成漏报。或者为了减少这种情况而提**性报警率（通过降低仪器报警的阈值），提高了复片的比例从而造成假阳性率偏高，失去了过筛的意义。鉴于以上这些问题， SYSMEX 近年来开始致力于通过化学染色方法对幼稚成份的标本进行自动化检测，这相对于一般的阳性报警（即提供一种可能性）要进步了很多。
对于红细胞系统，幼稚成份主要是网织红细胞和有核红细胞检测，提供定量的参数甚而可以对RET 成熟度作进一步的分类。在白细胞中，幼稚成份根据形态学的不同包括原始细胞、核左移细胞、幼稚粒细胞、异常/ 异型淋巴等。能否采用特殊的方法学（如核酸染色方法）高灵敏度地测得幼稚白细胞的存在，甚至提供定量的参数，是仪器优劣的标志之一。除了幼稚细胞以外，其它一些异常标本的检出率和准确性也通过技术的进步而得到提高。对于巨大血小板、血小板凝集、小红细胞或细胞碎片等标本，使用传统的电阻抗原理往往无法准确测的，而新的核酸染色技术结合光学流式原理则可以较好地解决。因此，可以灵敏、准确地检测出幼稚的红、白细胞存在（而非提供可能性），并具有血小板的形态辨识功能，成为血液分析仪发展的最前沿的功能。
二、核酸荧光染色技术
1.在白细胞系分析的应用
a. 正常五项分类的分析应用
由于电阻抗原理的局限性，二分群、三分群仪器都无法准确地检测出淋巴、单核、嗜酸性、嗜碱性、嗜中性细胞。为了能够从细胞体积大小到内部结构全面分析细胞并得到准确的白细胞分类结果，各种型号的五分类仪器采用了各项技术联合应用于血液细胞的分析，包括物理原理（电阻抗、散射光、高频波/
射频等）、化学原理（特异性溶血、普通颗粒染色、酶染色、核酸染色）。
在最新推出的SYSMEX XE-2100 系列、XT-2000i/1800i 系列五分类血液分析中，半导体激光作为光源将光束照射在流式细胞室内的白细胞，通过不同角度的散射光可以反映细胞外部的体积和内部颗粒复杂程度的信息。其中侧向信号用以反映细胞内部信息（主要是颗粒的复杂性）。试剂中增加了特异性针对DNA/RNA 染色的荧光染料Polymethine( 聚次甲基染料) 。激光照射后产生荧光信号，和侧向散射光一道绘制成二维散点图进行白细胞分类。
b. 幼稚白细胞分析的应用
白细胞中的幼稚成份在临床上具有显著意义。过去，此类标本主要依靠人工镜检。随着血液分析仪检测技术的发展，仪器对于幼稚白细胞的报警提示越来越灵敏。
通过一些特异性的化学手段，五分类仪器还可以进行幼稚白细胞的定量检测。SYSMEX XE/XT
系列采用核酸荧光染色后，根据细胞成熟度的不同可以体现在其荧光信号的强弱上，其白细胞分类通道出正常细胞分类外，还有两个幼稚白细胞的定量参数： IG
（幼稚粒细胞）和Other （原始细胞/ 异常淋巴）。临床研究表明IG
可以作为感染性疾病、白血病、炎症的有用参数，另外也提示治疗的预后和疗效监测
2. 在红细胞、血小板系分析的应用
a. 光学染色法检测PLT
通过光学技术，可以在一定程度上改善电阻抗原理仅仅判断细胞体积所带来的局限性，提高了红细胞和血小板的准确性。而现代生物染色技术的发展，使更加特异性的核酸染色法与光学技术结合成为可能。在SYSMEX
XE-2100 、XT-2000i
血液分析仪上，检测血小板的方法增添到两种。仪器的红细胞和血小板检测通道采用鞘流电阻原理，常规标本即以此为检测手段。当一些特殊标本混有大型血小板或小球性红细胞时，二者之中会有一部分具有相同的体积使电阻法无法准确区分，仪器还可以使用光学染色法检测(633nm
波长的半导体激光束，染料为Plymethine 和Oxazine) 。血小板由于体积较小，但颗粒中存在有少量RNA
，被染料轻微着色而激发出荧光，此时得到的血小板结果更加可信。
b. 网织红细胞分析
网织红细胞是晚幼红细胞脱核后与成熟红细胞之间的过渡细胞，是反映骨髓造血功能的重要指标。目前用自动分析仪进行网织红细胞分析的技术已经取得很大进展。随着五分类仪器技术日臻发展，
Sysmex XE-2100 、XT-2000i 具备了内置式的全自动网织红检测功能。采用激光流式原理和细胞核酸染色。除了进行自动的RET
数目和百分比计数外，还可以通过核酸染色得到的荧光信号强度区分低、中、高荧光强度的网织红（ LFR 、MFR 、HFR
）。由于幼稚的网织红荧光信号较强， MFR 和HFR 之和即反映未成熟网织红的一个有用参数。
桂林优利特公司研发的URIT系列五分类血细胞分析仪，全系产品具有网织红细胞检测功能，提供网织红细胞计数RET、网织红细胞比率RETIC和未成熟网织红细胞值IRF三项参数。
c. 有核红细胞分析
有核红细胞作为幼稚的红细胞在治疗监测和鉴别诊断时有重要临床意义。而且，有核红细胞体积与淋巴细胞相仿或略小，大多数仪器对这样的标本往往会误计，这样不但漏报了病理标本，而且造成白细胞（淋巴细胞）结果假性升高。随着五分类仪器的出现，仪器报警系统开始可以提示其存在的可能性，供操作人员镜检复核。
真正采用染色手段来自动化地定量检测有核红细胞的功能，出现在SYSMEX XE-2100 和XE-2100L 上。XE-2100 仪器单独设置检测有核红细胞的通道，特殊的溶血素将红细胞完全破坏，有核红细胞被裸核并收缩，而白细胞被保留。核酸荧光染色Polymethine 对标本染色后，白细胞细胞核和胞质内核酸的染色总量远大于同样被染色但被收缩的有核红细胞，通过半导体激光照射后荧光信号和前向散射光信号均有区别。由此准确计得有核红细胞数目及占白细胞的比例。
