PCR仪引物设计原则
引物长度要满足特异性需要,一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时最好在24~30个碱基之间；
· 当引入克隆位点时,引物末端应额外增加3个以上碱基；
· (G+C)%含量应尽量控制在40~60%,两条引物的(G+C)%含量应尽量接近；
· 引物中GC碱基分布均匀；
· 尽量避免相同碱基连续出现三次以上,3’端应避免使用A或T；
· 避免引物内部自身配对形成二级结构；
· 正反向引物之间应避免配对碱基,尤其是3’端的三个碱基,否则易生成引物二聚体(Primer dimer)；
· 两条引物的解链温度(Tm)值应在42~65℃之间,而且两条引物间最好相差不超过5℃；
· 引物Tm值的计算方法:
20 nt以下:Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上:Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt:引物的碱基数)
· 引物用量:
· 0.1~1.0 μM,通常可以0.2 μM起始,根据体系不同调整用量；
· 使用简并引物、随机引物时,需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大,特异性将降低；
· 模板较大较多,或结构较复杂(如人基因组DNA)时,需减少引物用量以提高特异性；
· 模板较小较少(如质粒模板)时,增加引物用量可提高产量。
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