数字PCR之Evagreen染料法（一）
EvaGreen®是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。作为新一代的绿色荧光核酸染料EvaGreen®，具有如下三个优势：
1.对PCR 的抑制小，因此在实验中EvaGreen®可使用快速PCR 温度循环，同时可以使用较高浓度，提高亮度的同时也消除了“染料重新分布”；
2.稳定性极强，在储存、操作和PCR过程中不会被破坏，可以反复冻融；
3.降低了细胞膜透性，更加安全。
染料法dPCR实验反应体系含有一对用于扩增目的序列的特异区段的PCR引物和用于扩增产物使用的EvaGreen®染料。
EvaGreen®实验的步骤如下
1.引物和扩增子设计
引物设计的原则在qPCR和digital PCR中是一样的。具体的设计原则可以参照前面发表的引物探针设计原则。
2.实验准备
对于任何数字PCR实验需要准备：
数字PCR仪及专用耗材
PCR mix包含酶，dNTPs，buffer，Mg+
Evagreen
dH2O
普通PCR实验用品：tube chip 振荡器 离心机等。
3.反应体系
按如下反应体系配置MIX：
4.反应条件
*：根据实验引物的Tm值来决定
5.数据采集
根据所使用的系统，数据采集将采用芯片成像的形式(Naica™系统、QuantStudio™3D数字PCR系统、CONSTELLATION®数字PCR系统……)，或者类似于流式细胞术(QX200™液滴数字PCR系统、Raindrop™数字PCR系统)，逐个读取分区。请按照制造商的说明执行此步骤。
6.数据分析
在EvaGreen digital PCR实验中，只有一个荧光通道需要检查，因此数据将被表示为一维点图。其中每个点表示一个分区，y轴表示蓝色检测通道中各分区的荧光强度，x轴表示分析软件分配给各分区的指标编号。
6.1数据质控
根据数据采集的类型，数据分析软件可以提供不同的质量控制。应当仔细考虑两项标准：
NTC：NTC只用阴性微滴
总微滴数：大量的可分析分区将减少与测量浓度相关的不确定性
在Naica™系统上，还可以可视化生成的分区:
