瘦素在海人酸诱导小鼠颞叶癫痫海马损伤中的作用
摘要：
目的 探讨瘦素 (Leptin) 与颞叶癫痫发生、发展过程的关系。
方法 外源 Leptin 注射 C57BL/6J 小鼠后，右侧海马微量 注射 200 ng 海人酸 (kainic acid，KA) 诱导颞叶癫痫，记录小鼠癫痫评分，1 周后观察小鼠海马病理变化，包括 Western blot 检测 Bax 的表达水平，尼式染色 (Nissl staining) 观察海马 Hilus 区神经元丢失，免疫荧光检测 Hilus 区星形胶质细胞活化与 增殖。结果 在 200 ng KA 诱导的颞叶癫痫模型基础上，10 mg/kg 外源 Leptin 预处理后，癫痫评分增加约 52%，Bax 表达水 平升高约 75%(P ＜ 0.05)，海马 Hilus 区神经元丢失严重，星形胶质细胞过度活化。
结论 Leptin 增加了 KA 诱导的神经元凋 亡，加重 KA 诱导的神经病理过程。
材料和方法
1 材料
C57BL/6J 小鼠 (SPF 级，60 只 )，8 周龄， 雄性，体质量 20 ~ 22 g，购自解放军总医院医学 实验动物中心；标准饲料 (10% KJ%fat，饲料 ) ；海人酸 (kainic acid，KA)(Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；人重组 Leptin(Peprotech公司 ) ；三羟甲基氨基甲烷 (Tris 碱 )( 北京益利精 细化学品公司 ) ；脑立体定位仪 (ZS-B/C，北京众 实迪创科技发展有限责任公司 ) ；5μl 微量进样 器 Microliter Syringes( 上海高鸽工贸有限公司 ) ；乙醚 ( 北京益利精细化学品公司 ) ；甲苯胺蓝 (Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；RIPA 裂解液、 BCA 蛋白定量试剂盒、Western Blot 超敏发光液 ( 北京普利莱基因技术公司 ) ；一抗 ：Bax(Epitomics 公司 )，β-actin(Santa Cruz) 胶质纤维酸性蛋白 (GFAPCell Signaling Technology Inc. #3670)、 瘦 素受体 (ObR，Santa Cruz Biotechnology) ；二抗：山 羊抗鼠 Alexa Fluor(R)488，山羊抗兔 Alexa Fluor(R) 555(1 ∶ 400，Cell Signaling Technology Inc.)、山羊 抗兔 IgG/ 辣根酶标记 ( 北京中衫金桥公司 ) ； Hochest33342(Sigma) ；柠檬酸盐缓冲液 ( 北京普利 莱基因技术公司 )。
2 颞叶癫痫小鼠模型的建立 [5]
将 C57BL/6J 小鼠 分为 0.9% 氯化钠注射组 ( 对照组，10 只 )，Leptin将硝酸纤维素膜放入含 5% 脱脂奶粉 (TBST 溶解 ) 塑料袋中，放入摇床 37℃封闭 1 h，将稀释好的一 抗，Bax(1 ∶ 1 000)、β-actin(1 ∶ 500)，4℃封闭 过夜。取出后放室温 30 min，TBS/T 漂洗膜 3 次 ×10 min，加入稀释好的二抗 (1 ∶ 3 000)，37℃孵育 30 min，TBS/T 漂洗硝酸纤维素膜 3 次 ×10 min，加入发光液，暗室曝光。扫描后，使用 Image Plus 6.0 软件，分析其灰度值，3 次独立实验求平均值。
1.尼式染色 (Nissl staining) 4 μm 石蜡切片脱蜡 至水，用磷酸盐缓冲溶液洗 2 min，放 1% 甲苯胺 蓝溶液中室温 20 min，用梯度酒精依次脱水，结 果尼式小体呈深蓝色颗粒，细胞核呈淡蓝色，背 景基本无色。
1.免疫荧光双染法观察 ObR 和 GFAP 共表达 注射海人酸后的小鼠冠状面石蜡切片 (4 μm) 脱蜡 至水，柠檬酸盐缓冲溶液高压修复 5 min，5% 山 羊血清封闭，加入一抗瘦素受体 (ObR) 和胶质纤维 酸性蛋白 4℃过夜，漂洗后，加二抗 Alexa Fluor (R) 488，Alexa Fluor (R) 555，37℃孵育 40 min，Hochest 33342 染核，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照，
癫痫是神经系统中仅次于脑血管疾病的第二 大病种，大部分可以用药物控制，30% 癫痫患者 会发展为难治性癫痫，其中颞叶癫痫占很大部分。 颞叶癫痫常见的病理学改变是海马硬化、萎缩、 海马特定部位神经元丢失，胶质细胞增生 [7]。苔藓 纤维出芽是人类颞叶癫痫的典型病理特征，苔藓 纤维是齿状回颗粒细胞的轴突，正常情况下苔藓 纤维是同海马 Hilus 区和 CA3 区锥体细胞的树突建 立联系，在海人酸诱导损伤的情况下，Hilus 区神 经元和 CA3 区神经元显著丢失，苔藓纤维与靶细 胞失去联系，触发苔藓纤维异常出芽与自身胞体 和树突形成自身反馈的兴奋性突触，另外内分子 层的传入纤维起始于 Hilus 区神经元，Hilus 区神 经元的丢失使苔藓状纤维发芽构成新的传入通路， 形成异常的自反馈，在癫痫反复发作中起到重要 作用 [8-10]，海马 Hilus 区在癫痫的发作中也起着重 要作用。本研究采用海人酸诱导的颞叶癫痫小鼠 模型，重点观察小鼠海马 Hilus 区的病理变化。
瘦素是一种主要由脂肪细胞分泌并释放入血 的多肽类激素，其可通过血脑屏障作用于中枢神 经系统调节能量代谢 [11]。近年绝大部分研究表明， 瘦素具有减轻神经损伤的作用，如在脑缺血、阿 尔茨海默病、帕金森病，谷氨酸诱导的癫痫中均 有保护作用 [12-14]。少量研究表明，高瘦素水平对 癫痫的发生具有促进作用 [15]，但是具体原因还不 清楚。根据 Lynch 等 [15] 的研究，本文章探讨腹腔 注射 (10mg/kg) 瘦素在海人酸诱导的颞叶癫痫模型 中的作用以及可能的潜在机制。
本研究观察了 Hilus 区的神经元及星形胶质细 胞在颞叶癫痫小鼠海马损伤中的变化。在海人酸 诱导颞叶癫痫基础上，瘦素预处理后小鼠的癫痫 行为评分增加，病理显示海马 Hilus 区神经元丢失 加重，可能是由于小鼠海马内凋亡蛋白 Bax 表达 显著升高，导致神经元抗凋亡能力下降。神经元 和胶质细胞是人脑的主要构成组分，胶质细胞数 量是神经元的 5 ~ 10 倍，其中数量最多的是星形 胶质细胞，星形胶质细胞平铺并紧紧包裹着神经 元和血管，长期以来星形胶质细胞被认为主要对 神经元起营养和支持作用，对维持神经元外的微 环境起着至关作用 [16]。星形胶质细胞的活化与病 理刺激的严重程度相关，神经胶质酸性蛋白是星形胶质细胞的特异性标记物，在活化的星形胶质 细胞中显著增加，常用来鉴别大脑损伤区与非损 伤区的星形胶质细胞 [17]。在神经元丢失后，星形 胶质细胞增殖活化既可以起到填充的作用，也可 将损失部位隔离，但过度活化的星形胶质细胞形 成的瘢痕、星形胶质细胞内谷氨酸合成酶含量降 低也是癫痫反复发作及难以治愈的重要因素 [18-19]。
本研究发现，瘦素预处理后，颞叶癫痫小鼠海马 Hilus 区 GFAP 表达增加，星形胶质细胞过度活化， 呈现反应性星形胶质细胞形态主要表现为细胞增 生和细胞形态发生改变，包括胞体肥大变粗、突 起增加、延长、聚集成簇。外源性给予一定量的 瘦素会加重海人酸诱导的病理损伤，其可能原因 是降低神经元的抗凋亡能力，过度激活星形胶质 细胞。瘦素可能作为研究颞叶癫痫的新的切入点。
