两种MALDI-TOF MS快速鉴定血培养中白念珠菌以外酵母样真菌
引言
随着广谱抗菌药物的广泛使用, 念珠菌血症的发生率在过去10年中已上升了5倍。在美国, 念珠菌已成为院内血流感染第4位的常见病原菌。有研究显示非白念珠菌在念珠菌血症的分离率和对抗真菌药物的耐药率正逐年上升。因此, 念珠菌血症早期诊断对患者预后十分重要。但目前临床微生物实验室使用的传统表型生化方法鉴定菌株需要24~48 h, 且准确性不高。使用分子生物学方法如聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)等方法鉴定, 费用昂贵, 对操作人员技术要求高, 不能成为实验室常规的检测方法。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近几年发展起来的基于微生物蛋白指纹图谱鉴定病原菌的方法, 具有快速、准确、灵敏和分辨率高等特点。本研究分析、比较2种不同的MALDI-TOF MS系统以及传统鉴定方法鉴定血培养中白念珠菌以外酵母样真菌的鉴定效果。
材料和方法
一、菌株来源
收集2010年10月至2013年1月复旦大学附属中山医院住院患者血培养分离到的59株白念珠菌以外酵母样真菌。所有菌株在SDA(自配干粉购自Oixid公司)培养基分纯, 30 ℃培养24 h后备用。
二、方法
1.API 20C AUX 板条鉴定
挑取新鲜菌落制成2麦氏浊度的菌悬液, 吸取100 μ L菌悬液转入API 20C培养基安瓿内, 然后将安瓿内的悬浮液注入AUC板条的杯内, 30 ℃孵育48~72 h, 读取鉴定结果。
2.Autoflex MALDI-TOF MS鉴定
根据Bruker Dahonics公司提供的标准操作流程, 先挑取新鲜菌落于500 μ L无菌高效液相色谱级水, 18 759× g离心2 min, 弃上清液。加入1.2 mL 70%乙醇混匀, 18 759× g离心2 min弃上清。加入20 μ L 70%蚁酸全速混匀10 min。再加入20 μ L 100%乙腈, 全速混匀10 min。18 759× g离心2 min后, 取上清液用于MALDI-TOF MS分析。取1 μ L上清液在MALDI-TOF靶板上点样, 待样本干燥后, 取1 μ L基质液(50%乙腈和2.5%三氟乙酸的α -氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液)覆盖于样本上。样本和基质液均匀干燥, 将靶板放入MALDI-TOF MS仪, 仪器设定如下:正线性模式, 激光频率60 Hz, 加速电压20 kV, 离子源加速电压16.7 kV、170 BS离子延时引出。每个样本重复采样500次, 如未获合格的图谱则追加100次, 直至总数达到1 000次。质谱区间设定的质荷比(m/z)为2 000~20 000区域, 波峰的信号强度必须> 0.07。蛋白校准品(大肠埃希菌DH5a蛋白抽提物, 由德国Bruker Daltonics公司提供)单独点样作为阳性对照, 基质液为阴性对照。质谱分析:Autoflex MALDI-TOF MS分光计和Flexcontrol 3.0软件相结合获取和分析样本质谱, 应用MALDI Biotyper 3.0软件将样本的质谱图与Bruker Daltonics标准数据库进行比对。鉴定分值分为0~3, 其中2.000~3.000表示可鉴定到菌种, 1.700~1.999表示鉴定到属, 0.000~1.699表示不能可靠鉴定。
3.Vitek MALDI-TOF MS鉴定
根据Vitek MALDI-TOF MS标准操作流程, 用1 μ L定量接种环直接挑取新鲜菌落涂在靶板点位内, 先加0.5 μ L Vitek MALDI-TOF MS FA试剂待干燥, 再将标准菌株ATCC 8739(由法国生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校准点位中, 所有检测位点加入1 μ L Vitek MS-α -氰基-4-羟基肉桂酸基质液, 待干燥后放入MALDI-TOF MS仪器获取细菌全细胞蛋白质谱, 然后将待测菌质谱和数据库(MS-IVD数据库V2.0版本)已知菌质谱进行比较、分析从而获得鉴定结果。Vitek MALDI-TOF MS结果分为3种颜色:绿色表示唯一的鉴定结果, 可信概率(60.0%~99.9%); 黄色表示低分辨率结果, 可信概率(> 60.0%)需要进一步做补充试验才能确定; 红色表示不能鉴定, 可信概率(< 60.0%)与数据库的任何质谱不匹配[4]。
4.真菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列分析
细菌DNA通过酵母基因组DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)提取, PCR扩增引物、反应条件及反应体系见文献[5]。扩增引物序列为ITS3(5'-GCATATCAATAAGC-GGAGGA-3')和ITS4(5'-GCATCGATGAAGAAC-GCAGC-3')。PCR扩增产物交与北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序, 测序后获得的序列在BLAST网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行在线比对。
三、统计学方法
使用SPSS 18.0统计软件进行分析, 选用Fisher Exact Test检验统计, 以P< 0.05为差异有统计学意义。
结果
59株真菌经ITS序列分析鉴定, 念珠菌属53株, 新生隐球菌2株, 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomy cesanomalus)2株, 阿萨希毛孢子菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)各1株。其中47株经3种系统鉴定结果一致, 包括近平滑念珠菌22株, 热带念珠菌11株, 光滑念珠菌8株, 克柔念珠菌2株, 新生隐球菌2株, 季也蒙念珠菌1株和葡萄牙念珠菌1株, 见表1。有12株鉴定结果不一致, 见表2。以ITS序列测序结果为金标准, 3种系统鉴定真菌的准确性分别为:Autoflex MALDI-TOF MS 93.2%, Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%, 2种MALDI-TOF MS比较, 差异无统计学意义(P=0.155)。对白念珠菌以外酵母样真菌的鉴定准确性分别为Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%, Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%, 2种MALDI-TOF MS比较, 差异具有统计学意义(P=0.006)。其中98.1%念珠菌属Autoflex MALDI-TOF MS的鉴定值> 2.000, 只有1株克柔念珠菌的鉴定值为1.979。由于Vitek MALDI-TOF MS的IVD2.0数据库和API 20C AUX菌种库内没有包括近平滑念珠菌复合体的其它亚种(Candida metapsilosis和Candida orthopsilosis), 故不能区分“ Candida metapsilosis” 。3种系统对念珠菌属外的少见真菌(新生隐球菌、异常威克汉姆酵母、阿萨希毛孢子和酿酒酵母)鉴定准确性分别为Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS 66.6%和API 20C AUX 33.3%。
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讨论
绝大多数的侵袭性念珠菌血症是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌引起[6]。 根据报阳血培养的涂片结果, 使用Chromagar显色培养基能较好地分离和鉴定白念珠菌, 其准确性> 95%。但是对那些不显色的非白念珠菌如近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌等, 显色培养基无法鉴定到种。目前国内临床微生物室所使用其它系统如API 20C AUX对非白念珠菌的鉴定一般需要18~70 h左右, 时间较长, 并且需要接种米饭培养基等。全自动微生物鉴定仪虽然操作较为简便, 但也需要16~18 h, 且影响因素较多, 如果不能鉴定, 只能重新操作或选择其它鉴定方法。随着近几年血培养中非白念珠菌分离率、耐药率的提高及非白念珠菌血症病死率的上升, 传统鉴定的方法已经不能满足临床医生及时准确诊断侵袭性非白念珠菌血症的需求。
近年随着对细菌蛋白提取和解析技术的发展, MALDI-TOF MS作为一种新技术, 通过提取分析某种微生物特定表型或基因型特征性的生物标志物, 利用已有蛋白质谱指纹图谱数据库中的信息对微生物进行的种属鉴定, 已经在临床得到越来越多的运用。
本次研究比较目前国际上2家主流的MALDI-TOF MS鉴定系统(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)结果发现, 2种MALDI-TOF MS结果对血培养常见真菌的鉴定准确性非常接近(P> 0.05)。但是由于Vitek MALDI-TOF MS系统使用的IVD2.0数据库没有包含近平滑念珠菌复合体的其它亚种和季也蒙念珠菌复合体其他亚种的数据。因此, 对于临床血培养常见的非白念珠菌, Vitek MALDI-TOF MS鉴定准确性逊色于Autoflex MALDI-TOF MS(P< 0.01), 这和台湾CHAO等报道的结果相似。对于少见酵母菌鉴定的准确性, 由于本次试验菌株数量较少, 不能做出准确的评估, 有待进一步验证。使用Vitek MALDI-TOF MS鉴定真菌, 从靶板样本制备到检测完毕大约30 min, 而且一次性能够检测48株菌, 而Autoflex MALDI-TOF MS由于需要溶菌提取真菌蛋白, 其操作比Vitek MALDI-TOF MS繁琐、耗时。但2种MALDI-TOF MS鉴定系统均比API系统省时。
综上所述, MALDI-TOF MS鉴定系统和目前常规生化方法相比, 对多数酵母菌的鉴定具有快速、简便、准确等优点, 是对传统微生物检测方法的补充, 为真菌鉴定提供了新的选择。随着质谱数据库的建立和不断完善, MALDI-TOF MS技术在真菌以及其它微生物检测等方面的应用将会更加广泛。
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