低密度脂蛋白胆固醇的检测方法与标准化研究
众多流行病学、遗传学与临床研究证实，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)的发生率呈正相关，通常以高LDL-C作为CHD的首要致病因素。美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗专业组规定以LDL-C水平作为高脂血症的分类与治疗基础及需要达到的治疗目标。作者参考新近有关文献，对LDL-C的检测方法及标准化问题作一简述。
一、LDL的生物化学
LDL是一组不均一的富含胆固醇的脂蛋白颗粒，漂浮密度(d)为1.006～1.063 kg/L。LDL中胆固醇酯(CE)、磷脂(PL)、蛋白质(Pro)、甘油三酯(TG)和未酯化胆固醇含量分别约为38%、22%、21%、11%和8%。应用非变性梯度凝胶电泳法或密度梯度超离心法可将LDL分为3种或更多亚组分，其名称也因实验方法而异。在LDL亚组分中有一部分LDL的颗粒较小(直径＜26 nm)，密度较大(1.04～1.06 kg/L)，称为小而密LDL(small，dense LDL)，亦称B型LDL；一部分LDL的颗粒较大(直径＞27 nm)，密度较小(1.02～1.03 kg/L)，称为大而轻LDL(large，buoyant LDL)，亦称A型LDL；介于两者之间的亚组分称中间型LDL［1］。近年小而密LDL与CHD的关系越来越受到重视，小而密LDL升高，或在整个LDL中所占比例升高与致AS的脂蛋白表型之间有着密切关系，这种脂蛋白表型常有HDL水平低和高TG血症的特征。
二、LDL-C的测定方法
测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等，应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL组分中胆固醇含量。公式计算法在临床与科研中应用较广，近年相继报道一些均相测定法已引起人们极大兴趣与广泛关注。
1.超速离心法：美国疾病预防与控制中心(CDC)测定LDL-C的参考方法为超速离心法(Beta- quantification，β-定量法)，也为NCEP所推荐［2，3］。方法基本同HDL-C测定。即用超速离心法除去VLDL组分(d＜1.006 kg/L)后，测定d＞1.006 kg/L组分的总胆固醇(Chol)含量，减去HDL-C。计算方法：［LDL-C］=［d＞1.006 kg/L Chol］-［HDL-C］。此法测定的LDL-C，实际上包括脂蛋白(a)［Lp(a)］和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量，也是评价其他检测方法准确性的基础。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。β-定量法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。
2.Friedewald公式计算法：此法是目前应用较广的估测LDL-C的方法，其以VLDL组成恒定(VLDL-C/TG=0.2，均以mg/dl计）的假设为前提，具有简便、直接、快速等优点。计算公式为：(1)LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2(以mmol/L计)。(2)LDL-C=TC-HDL-C-TG/5(以mg/dl计)。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响。Friedewald公式法计算LDL-C的总变异达9.5%，故需要TC、TG和HDL-C测定结果准确且符合标准化的要求［2］。如某项测定值误差较大，则会导致计算结果不可靠，因而使其临床应用受到更多挑战与限制。下列情况不宜采用Friedewald公式法计算：(1)血清中存在CM。(2)血清TG＞4.52 mmol/L(400 mg/dl)时。(3)血清中存在异常β脂蛋白时［Ⅲ型高脂血症(HLP)］［3］。近来Planella等［4］报道一种根据apoB、TC和TG估算LDL-C的新公式，其不受高TG血症影响，可准确用于非乳糜微粒血症的分类。Planella公式为：LDL-C=0.41 TC-0.32TG+1.70 apoB-0.27(TC、TG以mmol/L计，apoB以g/L计)。此法测定LDL-C的不精密度为1.45%，低于Friedewald公式法(2.97%)，与β-定量法结果明显相关。应用此法将非乳糜微粒引起的高脂血症进行分类，其与β-定量法分类的平均符合率为96.8%，亦高于Friedewald公式法(93.0%)。该公式法不受高TG的影响，在一些方面更优于Friedewald公式法。但此法易受apoB测定结果的影响，需对其测定进行标准化。
3.化学沉淀法：常用方法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等。血清中LDL经选择性沉淀后，测定上清液中的Chol代表HDL-C与VLDL-C之和，用TC减去上清液Chol即得LDL-C值。因PVS法为非离子反应，实验条件要求不高，在pH 3～8范围内均可完全沉淀且PVS不干扰酶法测定Chol，故目前商品试剂多采用PVS法。中华医学会检验学会在国内推荐PVS法作为LDL-C测定的常规方法［5］。本法沉淀物中也包含IDL和Lp(a)。Lp(a)与LDL的化学组成、物理性质和免疫原性极为相似，Lp(a)含胆固醇约30%，在Lp(a)增高时，可从LDL-C测定值中减去Lp(a)×0.3(以mg/L计)。特别是在低LDL-C水平时，最好同时测定LDL-C与Lp(a)，否则可能掩盖高Lp(a)的存在，也便于校正LDL-C值及比较两项指标在冠心病危险因素估计作用中的大小［6］。但目前亦存在一些争议。这类方法主要缺点是TG水平较高(＞4.52 mmol/L)时，有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。Reference Diagnostics公司近来推出一种简便可靠的磁性分离法测定LDL-C的试剂盒，其原理是血清与磁性分离剂混合后37°C孵育10分钟，然后将分离管放在磁性物表面，LDL颗粒在多聚阴离子作用下因被磁化而很快被去除。用TC减去上清液中非LDL-C含量即为LDL-C值［7］。此方法简单迅速，结果准确，精密度高(批内、批间CV均＜2.5%)，与Friedewald公式法相关性好(r=0.942)，与β-定量法结果一致。此法不受高TG干扰，有一定应用价值。
4.免疫分离法(Immunoseparation Method)：由Leary等［8］于1993年首先报道，Genzyme Diagnostics建立的一种相当简便直接测定LDL-C的方法。目前Sigma及其他一些公司已有可供临床应用的商品试剂盒。先将200 μl用PEG和结合有抗人apoE、apoAⅠ多克隆抗体的胶乳珠分离试剂与30 μl血清标本同时加到专用分离管的内管(含200 nm滤膜)中，混匀后置室温5～10分钟，让血清中HDL(含apoAⅠ/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAⅠ/E)与分离试剂中的抗体反应结合；然后以1 200～12 000×g(一般为2 200×g)速度离心沉淀5分钟；置室温平衡后，取出并弃去内管；用酶法测定分离管外管中滤液胆固醇含量，即可确定血清LDL-C水平。国外已有许多作者对此法进行了系统评价［2，8～10］。多认为此法精密度好(批内、批间CV＜3%)，准确度高，特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与β-定量法有较好相关性，不受高TG水平的影响，可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管，试剂成本较高，难以自动化。且不适于冰冻或冻干标本的测定，如用冰冻标本LDL-C值会下降达25%，用冻干标本可产生50%～75%的负偏差。Levinson等［11］认为免疫分离法应用范围相当有限，对于空腹血清TG＜4.52 mmol/L的患者和TG在1.70～2.83 mmol/L的多数患者，用Friedewald公式法估算LDL-C似乎更好。免疫分离法可用于TG＞4.52 mmol/L的少数患者LDL-C的检测，对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。
5.均相测定法(Homogeneous assay)：由于化学沉淀法和免疫分离法测定LDL-C均需要进行样本预处理，其最大缺点是不能进行自动化分析，不适应大规模流行病学调查或临床大批量标本诸多项目同时检测。国外近两年相继研制开发出几种不同类型的均相测定法，标本不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪自动测定。(1)选择性反应法［12～14］：基于用表面活性剂控制酶与相应脂蛋白的反应的新技术研制而成，多为液体双试剂。目前有两类检测系统：第一类系统的试剂1中的表面活性剂 1可使血清样品中的HDL、CM和VLDL颗粒解离，Chol分子被释放出来，与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时LDL颗粒仍是完整的。加试剂2(含表面活性剂2和偶联剂DSBmT)，它可使LDL颗粒解离释放Chol，参与Trinder反应而显色，因其他脂蛋白的Chol分子已除去，色泽深浅与LDL-C量呈比例［12，13］。日本第一化学药品株式会社(Daiichi)的DA-6101、Genzyme Diagnostics公司的N-genousTM LDL-C试剂盒均属此类方法。此法所需标本量少(3 μl血清)，精密度高(批内、批间CV＜2.5%)，线性范围可达4.52 mmol/L，回收率90%～110%，与β-定量法及免疫分离法相关性均好(r=0.958～0.992)，基本不受VitC、胆红素、血红蛋白及γ球蛋白等影响。TC、TG分别高至14.7 mmol/L，20.5 mmol/L时，对LDL-C测定无明显影响。第二类系统的试剂1含α-环糊精硫酸盐、硫酸葡聚糖(DS 500)、MgCl2、EMSE和MOPS，试剂2中含CHER、CHOD、过氧化物酶、4-AA、POE-POP和MOPS。α-环糊精硫酸盐在少量DS及Mg2+存在下，可减少CM和VLDL组分中的胆固醇与酶试剂的反应。多聚物聚氧化乙烯-聚氧化丙烯封闭共聚多醚(POE-POP)可减少HDL组分胆固醇的反应。两者结合则可选择性的测定LDL-C［14］。此法在TG为0.3～22.6 mmol/L范围内与β-定量法具有较好的相关性，检测线性可达15.5 mmol/L，最小检测浓度为0.005 mmol/L，回收率为97%～105%，除当结合胆红素、枸橼酸盐的终浓度分别高至0.68与12.9 mmol/L时，可使LDL-C测定结果分别降低10%或7.8%外，基本不受其他物质的干扰。(2)透射比浊法［15］：Boehringer Mannheim公司基于多聚阴离子试剂PAMPS与LDL颗粒发生特殊凝集反应设计而成。试剂1中的两性离子表面活性剂可使样品中HDL、CM和VLDL(富含TG)颗粒遮蔽。加试剂2［含触须状多聚阴离子(PAMPS)和两性离子表面活性剂］，在Mg2+存在下，LDL颗粒与PAMPS作用形成LDL-触须状多聚阴离子复合物，所产生浊度与LDL-C含量成比例。此法与β-定量法相关性好(r=0.97)，批间CV为0.9%～5.7%(LDL-C在1.25～8.40 mmol/L之间)，标本在1.3～10.4 mmol/L范围内不需预稀释，实验室间可比性平均CV为4.7%，不受黄疸、溶血干扰，TG＞4.52 mmol/L也不影响测定结果，亦不受肝素等31种治疗药物的干扰。但此法在Technicon系列等自动生化分析仪上的应用受到一定限制。(3)PEG修饰法：基于PEG修饰酶(CHER/PEG，CHOD/PEG)对不同脂蛋白胆固醇反应的选择性结合表面活性剂的作用设计而成。首先试剂1中多聚阴离子和表面活性剂封闭血清中LDL颗粒，让HDL、VLDL、CM颗粒解离，释放出Chol与酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色。加入试剂2后，LDL-C参与显色反应，色泽深浅与LDL-C量呈比例。日本协和(Kyowa)公司已研制出商品试剂盒供临床应用。但目前尚乏见有关此法的评价报告。
6.电泳法：在一定电场条件下，由于各种脂蛋白的颗粒大小及其在缓冲溶液中所带电荷数的不同，故在支持介质(如琼脂糖凝胶)上迁移率亦不同。较小的HDL颗粒向阳极有较高的迁移率，再依次为Lp(a)、VLDL与LDL，LDL紧靠阴极端，胆固醇染色后即可确定各种脂蛋白胆固醇的百分率。结合血清TC值，即可确定LDL-C值［16］。Helena公司已有可供REP电泳仪使用的检测LDL-C的试剂盒，并可同时检测VLDL-C、HDL-C和Lp(a)-C，可用于高脂血症的诊断与分型。此法测定的是单纯LDL-C，不包含Lp(a)中的胆固醇，特别适合TG＞4.52 mmol/L的标本LDL-C的测定。对每种脂蛋白带胆固醇的线性至10.4 mmol/L，分析敏感性0.065 mmol/L。测定LDL-C批内CV为1.3%～2.7%，批间CV为3.7%，与β-定量法有良好的相关性(r=0.998)，总体偏差约6.0%。电泳法测定LDL-C总误差约为13.3%，略高于NCEP推荐的12.0%。
三、LDL-C检测的标准化
LDL-C是血脂分析的常规项目，高LDL-C与临床心血管病事件发生率密切相关。由于目前国内外尚缺乏LDL-C测定的正式标准化方案，使得其标准化工作更为困难。LDL-C检测的标准化主要在于标准化方案的制定与实施、标准物质和质控材料的制备及方法的合理选择与测定标准化。
1.标准化目标：LDL-C测定的变异主要来源于生理变异(CVb)和分析变异(CVa)，研究表明LDL-C的CVb为6%～11%(平均8.2%)，CVa为3%～7%(平均4%)。NCEP对LDL-C测定的分析目标进行了规定，要求总误差≤12%；不精密度要求CV≤4%，不准确度要求偏差≤4%(与β-定量法测定参考值比较)。
2.标准物质和质控材料：LDL-C标准化的主要难点是缺乏不受基质效应影响或影响甚小，且能长期用于监测LDL-C测定的参考物质与质控材料。目前国内外尚无LDL-C测定的决定性方法与1°级参考材料，NCEP推荐CDC的β-定量法为参考方法，2°级参考材料为CDC冰冻血清(NIST SRM 1951a，CAP RM 026)。CDC的标准化工作也刚开始，首先进行的工作是在胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)和脂质实验室标准化专家组(LSP)实验室转移CDC参考方法，使之具有可溯源性。制备参考血清时，如进行加工或添加某些成分(如制备的LDL)，会使某些分析系统出现基质效应，即新鲜血清标本的分析结果出现明显偏差。CDC研究证明LDL-C对血清冰冻比其他血脂指标敏感，血清冰冻后LDL-C下降(约1.6%)，但LDL-C下降发生在冰冻初期，在以后的贮存中不再下降，说明冰冻血清用于LDL-C参考方法的标准化是可行的［17］。上述几种测定方法中，以免疫沉淀法对冰冻血清最为敏感，血清冰冻后再复融，LDL-C测定值会明显下降。目前尚乏见血清冰冻对各种检测方法结果影响的系统研究报道，总的来说用定值冰冻血清作为参考材料优于冻干品，LDL-C的测定推荐使用新鲜血清。近年陆续引进的自动化检测方法为LDL-C的检测提供了方便，但对校准品和质控材料要求更高。一方面希望其能用于方法校准、标准化和质量控制，能用于国际和国内室间质评；另一方面亦希望能同时用于其他项目的校准和质控。这也是当前LDL-C检测所面临的难题之一。
3.检测的标准化：NCEP近来对LDL-C的测定进行了系统回顾与总结，分析了LDL-C测定的变异来源，推荐了LDL-C测定的参考方法与常规方法，并对厂商、保健人员、实验室及政府机构与专业组织提出了相应的建议。NCEP暂推荐CDC的β-定量法为参考方法，Friedewald公式法为常规方法。国内近年已广泛推广化学沉淀法(如PVS法)直接测定LDL-C，这也是必然趋势，需要引起重视的是方法的合理选择与测定标准化，这样可防止临床应用中因测定结果不准确而造成的混乱。国内现已推行TC测定标准化，也有利于LDL-C标准化工作的开展。当前的任务是对分离条件规范化，同时研制开发出稳定可靠的参考材料与定值血清。目前相继开发的几种LDL-C直接测定法有一定临床应用前景，但需进一步进行系统评价与深入研究探讨。
