细胞的离心分离基础和分离实例（三）
4. 细胞离心分离过程中常常遇到的一些问题
i. 细胞聚集：
细胞聚集后在离心过程中的沉降行为与单个细胞完全不同，因此出现细胞聚集会影响分离纯度。避免的方法是添加一些防止粘结的成分如小牛血清白蛋白，脱氧核糖核酸酶（D Nase ，防止胶结）、蛋白酶（protease ）、EDTA 等；（参考文献6）
关于离心分离温度，有些论文设在4℃离心分离细胞效果很好，也有人认为初步分离时温度应保持在20℃以上。（文献7）
ii. 在梯度液中细胞过载：
在密度梯度离心中，每种细胞的数量都不能超过对应于它的密度的梯度液的容量， 也就是每种细胞在梯度液中所占有的梯度层的厚度是受限制的，过分厚的纯样品区带会与别的细胞的纯样品区带相重叠；这是问题的一方面。另一方面，虽然垂直管转头在高速离心时，它的离心管纵切面可以容纳更多的样品分子（与甩平转头的离心管横剖面相比较），但在离心完成、梯度从垂直方向转换到水平方向后，每个纯样品所占据的离心管中心轴上的宽度很大。如果初始样品中所含的细胞品种很多，纯化后也会造成纯样品带的重叠。关于这个问题没有精确的数学计算，全靠用户在实验中逐渐积累经验。这涉及待分离样品中细胞的浓度，和梯度离心时的加样量（2％～5％离心管容量）以及梯度的形状（梯度曲线的斜率，连续梯度或者阶梯梯度）等等。
iii. 壁部效应：
在角式转头中沿离心力方向沉降的细胞接近离心管壁部时，与在离心力分力作用下沿管壁下滑的细胞碰撞，造成在角式转头离心管近外壁部形成了一个“壁部效应区”，这个壁部效应区从离心管上部到下部逐渐加宽。由于壁部效应，可能会造成部分细胞的聚集而影响分离纯度，也可能有一小部分细胞由于碰撞而受损。这种影响在用固定角式转头作等密度离心时尤为显著。所以细胞离心分离除浮选转头外一般小容量选择甩平转头，大容量选择区带转头。
iv. 旋涡效应：
在加速或减速过程中在离心管中产生的小旋涡会影响梯度的完整，在减速过程中还会影响已被分离的纯样品带的宽度，转速500rpm～1000rpm 之间往往在复合向心力、也就是Coriolis 力的作用下在离心管中会产生涡旋，涡旋在下列情况下可以减少：
l 增加回转半径；
l 慢加速和慢减速（根据不同转头，不同容量，不同离心方法可以多档控制的加、减速速率）；
l 缩小离心管直径（∮10mm 以下，这在大多数情况下不现实）；
l 使用一些抗旋涡的缓冲液（文献5）；
l 应用有较陡斜率的密度梯度。
v. 液滴效应：
在预形成密度梯度液上表面加待分离的细胞样品，如果不马上离心，就会有很少的液滴滴入梯度层。这个现象在加样后几分钟内会发生，其结果是在样品与梯度液的界面上出现层间扩散（文献8）而影响分离效果，减少这种影响的方法是
l 降低样品浓度；
l 提高梯度液的初始斜率；
l 在铺完样品后立即放入转头并开始离心分离。
vi. 离心力的选择：
离心力选择不当会影响细胞活力改变、细胞的内部构造、影响细胞的裂介和复制。这种影响常出现在：
l 长时间的离心分离过程；
l 转头的快加速；
l 过大的离心力产生了较大的流体静压；
l 应用较高转速的等密度离心法。
如果我们选用较低的转速，粘度较小的梯度材料（本讲座文献18）；利用细胞浮选转头等都可以减少这种影响。
vii． 渗透效应：
很多细胞特别是哺乳动物细胞没有坚固的细胞壁，周围的介质很容易渗透到细胞内部或者细胞内液体反向渗透到周围介质中而引起细胞的膨胀和收缩，从而改变离心过程中细胞的沉降（或上浮）特性。因此配制等渗的梯度液是必要的（讲座文献18）
（二）实用细胞离心分离方法举例
（1） 血细胞纯化：
血细胞由多种类型的但细胞悬液组成，每种细胞都有它们自身的特性和功能并广泛被用于医学临床和诊断。多年来研究人员对血细胞分离纯化作了大量工作，实验室研究和血液成分分离都已广泛使用各种离心设备，如用于医学临床分析、诊断的全自动血细胞洗涤离心机（Hitachi MC-450,24 管，Sorvall CW-2,12 管），用于大量血液（标准200ml，300ml，400ml,500ml 三联或四联血袋）成分分离用的大容量低速、低温离心机（参考技术讲座文献1）等等。下面我们将以实验室研究为主线，举例说明各种血细胞分离纯化方法。
由B∮yum 研发并在多年来被普遍应用的血细胞纯化方法是用梯度材料Na-metrizaate 与Ficoll 的混合液作密度梯度离心，把血球中的红血球，多形核细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板分离纯化。这种溶液有不同的商品名称如Lymphoprep（Nycomed Pharma 公司）、Ficoll －pague （pharmacia-Biosystems 公司）等，都可以作这一用途。（文献9）
下面的例子是在室温下用低速离心机作血细胞分离的实验。
例1．人血中单核（白）细胞的纯化
i. | 用抗凝血剂处理血样，常用抗凝剂为0.32％柠檬酸钠。 |
ii. | 用等容积的生理盐水稀释血样。 |
iii. | 在10ml～15ml 离心管中先注入3ml metrizoate-Ficoll 分离液，在其上铺6ml 已稀释 |
血样。 | |
iv. | 用甩平转头600g（1,800~3,000ropm，台式机）×20 分，20℃。（ 不要在4—5℃低 |
温离心，否则分离效果将很差。 | |
v. | 离心后用巴氏移液吸管从血浆与分离液界面中间吸出血细胞层，其中含有单核（白） |
细胞和部分血小板。 | |
vi. | 加入几毫升生理盐水，降低收集的血细胞浓度。 |
vii. | 同一离心转头，同一离心管250g（1200rpm 左右）×5 分钟20℃。可以用同一工 |
艺在离心机中洗几次。 | |
viii. | 收集沉淀在生理盐水中保存。 |
