亚细胞构造的离心分离概论
现代生物学研究常常需要提取和纯化细胞及组织中的亚细胞构造(细胞核、质膜、内笪纲、高尔基体、线粒体、溶酶体、微粒体等等)。在经过选择的最合适的生物体匀浆制备后,用离心法提取和纯化亚细胞构造是最常用、也是最有效的实验手段。
(一)匀浆制备:
将生物体组织剪切成2~3毫米小块或小片,以每100毫升加湿重5~10克配置组织液,即可用下列各种匀浆设备制备匀浆。
(i)帖床式匀浆机:
最常用,可调速,磨头可手操作升降的实验室匀浆机。
常用聚四氟乙烯园柱型带球形顶端的磨头。定制的硬质玻璃容器,磨头在玻璃容器中既旋转又上下移动。磨头与容器间隙可根据需要调整在0.05~0.15毫米之间。
制备某些大温度敏感的材料,容器可固定在一个封闭园筒中,园筒通以冷却水,避免匀浆制备过程中这样品温度升高。冷却水可用自来水也可以用低温循环水槽的外循环冷却水。
这种匀浆机最常用于"软"组织(脑、肝等)的匀浆制备,常用将速在1500转/分以下,磨头上下升降5~15次。
(ii)剪切型匀浆机。
转头分为硬度、可产生相对剪切运动的多刀刃刀片,转速较高(10000转/分)下,可调。适用于较"硬"组织(肌肉,心肌,内脏等等)的匀浆制备。
(iii)高压 气体破碎法(主要是N2):20~100大气压,10~60分钟也可以制备匀浆。
(iv)超声波破碎机:可产生很高的液体剪切力。但对生物大分子(DNA,RNA等)有破坏作用,常用于只研究亚细胞结构的匀浆制备。
(v)大量样品用的制备型工业匀浆泵:综合利用机械剪切与细胞真空炸裂原理制造的高效匀浆(均质)设备用于生产型匀浆制备。
(二)过滤:根据样品的实际情况,在匀浆制备前或会,为了滤去某些不得不 破碎的组织颗粒,可用优质棉布或尼龙布(单层或多层)过滤样品。
(三)供参考的初步离心法:
(四)亚细胞构造的进一步纯化:
(i)溶剂:为了避免质膜及其他亚细胞器的损伤,保证在离心过程中组织不变性,常用的溶剂有1mM EDTA, 0.1~1mM PMSF, 5~10mM Tris或Hepes等等,具体配置请参阅有关文献。
(ii)差分法:经过多次繁复的差分离心分离也可以纯化各种亚细胞器,但常常是事倍功率:很大的离心工作量,得到不太高的纯度。由于离心技术的进展,目前已少用,本文不作介绍。(如果有人感兴趣,可与作者联系)
(iii)密度梯度离心法:(略,详见参考文献)
① 各种亚细胞构造的沉降系数范围:
细胞核:5×106~8×106
质膜(大片):105~6×105
质膜(小片):5×101~5×103
内质纲片断:101~103
溶酶体,线粒体:2×103~8×103
②各种亚细胞器的尺寸及其在典型梯度材料中的浮密度:
名称 | 尺寸 | 密度 | ||||
(µ m) | 蔗糖中 | Ficoll | Percoll | Metrizamid | Nycodenz | |
核 | 3~12 | >1.3 | / | 1.09 | 1.22 | 1.23 |
线粒体 | 0.5~2 | 1.19 | 1.14 | 1.10 | 1.16 | 1.17 |
溶酶体 | 0.5~0.8 | 1.21 | / | 1.06 | 1.13 | 1.15 |
质膜(大片)小颗粒 | 3~20 | 1.16~1.18 | ~1.05 | ~1.03 | 1.14~1.26 | 1.11~1.19 |
0.05~3 | 1.13 | |||||
内质网 | 0.05~0.3 | 1.06~1.23 | / | / | / | / |
③推荐的离心参数
方法 名称 | 差分沉降在0.25M蔗糖液中 | 速率—区带密度梯度离心5~20g蔗糖液中5℃ | 等密度离心(ISOPYCNIC)(同左或其他合适介质中) |
核 | 1000g×10分钟 | 500g×10分钟 | 4000g×60分钟 |
线粒体 | 10000g×20分钟 | 5000g×10分钟 | 80000g×100分钟 |
溶酶体 | 10000g×20分钟 | 5000g×10分钟 | 80000g×100分钟 |
内质网 | 150000g×40分钟 | 10000g×20分钟 | 100000g×200分钟 |
微粒体 | 100000g×60分钟 | 10000g×30分钟 | 10000g×360分钟 |
质膜大片 | 10000g×15分钟 | ~100000g×100分钟 | ~150000g×600分钟 |