hERG K+通道电流和药理学特性-Molecular Devices IonFlux（一）
简介
HERG (human ether-a go-go-related gene) K+ 通道在心脏中高表达，是心肌动作电位三期快速复极化电流(IKr)的主要组成部分(Curran ‘95; Sanguinetti ‘95)。hERG 突变引起的功能缺失常伴随一些遗传性长QT 综合症(LQTS) 并且会增加发生严重的室性心律失常, 扭转性实行心动过速 (Tanaka ‘97; Moss ‘02)的风险。HERG 钾离子通道被作用于心脏或非作用于心脏的药物抑制，都被证实有非常大的可能性出现获得性药物诱导的长QT 综合症(LQTS)，甚至导致猝死(Vandenberg, Walker & Campbell ‘01)。实际上，hERG 钾离子通道被抑制引起的副作用是近年来药物撤市的要原因，因而药物作用于外源性表达于哺乳动物细胞的hERG 通道的体外效应评价已被 国际药品注册协调会议（International Conference on Harmonization）推荐作为临床前安全性评价工作的一部分(ICHS7B Expert Working Group, ‘02)。hERG 钾离子通道药物效应评价的金标准方法是手动膜片钳记录。然而，这种低通量、高成本的方法在大量的安全性筛选实验中非常受限制。近年来，全自动膜片钳技术发展越来越成熟，可以获得高通量的、可与手动膜片钳记录结果相媲美的数据。IonFlux™ 系统结合了读板机的便捷和传统膜片钳技术的优秀性能。本文主要利用IonFlux 系统记录了在哺乳细胞中表达的hERG 电流以及一些阳性抑制剂对hERG 阻断效应的药理学特性分析。
材料和方法
细胞
实验中使用G418 筛选的稳定表达hERG 通道的CHO 细胞（Millipore PrecisION™ hERG-CHO Recombinant Cell Line, Cat# CYL3038）。细胞培养在含10%胎牛血清的Glutamax DMEM/F12 培养基 (Gibco,Cat# 11320) ，加有1% 青霉素-链霉素以及500 μg/mL G418。实验前至少提前24 小时将细胞转移至30℃培养箱中，或传代后一直放置在30℃培养箱中。细胞密度不能超过90%。收集细胞时，使用Detachin(Genlantis, San Diego, CA, Cat# T100100)消化细胞，冲洗并轻柔吹打，最后细胞悬浮在细胞外液中，浓度为每毫升2-5 百万个细胞。
溶液和化合物
细胞外液成分（ECS）含有（mM）：NaCl 145, KCl 4, MgCl2 1, CaCl2 2,HEPES 10, 葡萄糖 10，用NaOH 调pH 至7.4 。细胞内液成分（ICS）含有（mM）：KCl 120, HEPES 10, Na2ATP 4, EGTA 10, CaCl2 5.374,MgCl2 1.75，用KOH 调pH 至7.2。
hERG 抑制剂购自Sigma。化合物第一步全部溶于DMSO 中，制成高浓度的母液（10-50 mM），然后按照浓度梯度和最终外液中的终浓度的倍数关系进行下一步的稀释，因而最终相应的DMSO 浓度为（0.1- 0.3%）。DMSO 溶液（0.1- 0.3%）作为阴性对照的记录始终开始于抑制剂作用之前，且规定不能对电流幅度的影响超过10%。
Figure 1. IonFlux 高通量全自动膜片钳系统，采用“读板机”式模式，简化了工作流程、增加了实验通量。系统配有16 通道和64 通道两种型号，每天可以记录获取10,000 个数据点。
