组胺ELISA试剂盒使用说明（二）

2020.7.06

7、实验所需器材但试剂盒不提供

1）移液器，体积：10;20;50;100;1000ul

2）试管（12×75mm）

3）试管架

4）振荡器

5）旋涡混合器（500rpm）

6）带储器的8道移液器

7）洗涤瓶，自动或半自动洗板机

8）酶标仪（参考波长：600-650nm）

9）蒸馏水或去离子水

10）吸水纸、取样吸头和计时器

8、实验前的准备说明

注意	96人份的试剂盒可分成三份分别进行检测，下述体积为检测32人份时所需要的体积。

8.1冻干或浓缩成分的准备

(*)在稀释前,确保塞子内无残留液体.

8.2样品的稀释

样品中组胺浓度高于最高标准品的样品,应当在酰化前用相应的稀释液稀释,尿液样品用0.1M的HCl,血浆样品用样品稀释液（Cat.no. KEHP711）,试剂盒内未提供。

8.3样品的酰化

用试管准备样品

注意	不能血浆标准曲线确定酰化尿液或细胞培养样品中组胺的浓度,也不能用U/C标准曲线确定酰化血浆样品中组胺的浓度.

8.3.1血浆

1	将血浆标准品、血浆质控品和病人样品分别100ul加入到相应的试管中。
2	在每一试管中加入100ul指示缓冲液，旋涡混合。
3	在每一试管中加入20ul酰化试剂，加入酰化试剂后立即旋涡混合。
4	将试管盖好，室温（18-25℃）温育30分钟。
5	在每一试管中加入750ul已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。

8.3.2尿液，细胞培养上清

1	将U/C标准品、尿液质控品和病人尿液或细胞培养上清分别50ul加入到相应的试管中。
2	在每一试管中加入50ul指示缓冲液，旋涡混合。如果指示剂变成无色，说明溶液的pH值很低，样品中含有很多酸性物质。在这种情况下，再向试管中加入50ul指示缓冲液直至溶液略带微红。
3	在每一试管中加入10ul酰化试剂，加入酰化试剂后立即旋涡混合。
4	将试管盖好，室温（18-25℃）温育30分钟。
5	在每一试管中加入2000ul已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。

注意：酰化处理好的样品可在2-8℃下存放一晚，-20℃环境下可存放2天。

9、实验步骤

1	将酰化处理过的标准品、质控品和病人样品分别50ul加入到相应的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul临时配置好的酶联物。
3	在每一微孔中加入50ul组胺抗血清。
4	盖板，振荡器（500rpm）上室温温育3小时。
5	移去粘性金属板，弃取孔内反应物，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干以除去残余液体。
6	如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。
7	在每一微孔中加入100ul TMB底物液。
8	血浆：振荡器（500rpm）上室温温育40min。尿液/细胞培养上清：振荡器（500rpm）上室温温育20min。
9	在每一微孔中加入100ul TMB终止液以终止底物反应。轻轻振板使溶液混合均匀。
10	加终止液后15min内450nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm）