多巴胺ELISA试剂盒使用说明(二)
7、实验所需器材(但试剂盒不提供)
1)移液器(10;10-100;100-1000μL)
2)轨道摇床(200-900rpm)
3)旋涡混合器
4)带储器的8通道移液器
5)洗涤瓶,自动或半自动包被板清洗系统
6)酶标仪
7)双蒸水或去离子水
8)吸水纸,取样吸头,计时器
9)样品稀释用试管。
8、手动操作
8.1实验前说明
注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
注意 | 试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1:5的比例进行稀释(例如:20μL尿液+80μL 0.1M的HCl)。标准品无需稀释。 |
8.2样品的稀释
如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释:
样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
血浆 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
尿液 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
8.3样品、标准品和质控品的提取(提取板)
1) | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外,在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。 |
2) | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
3) | 盖板。在轨道摇床(600-900rpm)上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中,液体的表面应该会浸湿粘性金属板,但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
4) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
5) | 每孔加入2ml双蒸水 |
6) | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上(600-900rpm)18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
7) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
8) | 每孔加入150μL提取缓冲液,再向每孔中加入50μL酰化试剂,立即混合均匀。 |
9) | 在轨道摇床(400-600rpm)上18-25℃的环境下提取20min。(无需盖板) |
10) | 快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
11) | 每孔加入2ml双蒸水。 |
12) | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上(600-900rpm)18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
13) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
14) | 每孔加入300μL Release缓冲液。 |
15) | 在轨道摇床(400-500rpm)上18-25℃的环境下振荡30min。(无需盖板) |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话,您可将提取板用粘性金属板盖好,在2-8℃的环境下可存放一夜。
8.4冻干粉或浓缩成分的准备
稀释 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
25ml | 洗涤液 | 225ml | 双蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
60μL | 酶联物 | 6ml | 洗涤缓冲液(已稀释好) | 1:101 | 临时配置,仅能使用一次,混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 临时配置,仅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
9、实验步骤(手动操作)
9.1 COMT酶溶液的准备
注意:COMT酶溶液应在使用前直接临时配置 |
在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水,充分混和。再加入1.25ml酶联溶液,然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*,COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合,但要避免气泡产生,配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液,则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
9.2样品、标准品和质控品的酶化
注意 | 如果使用自动置换型移液器,请将取样吸头内的残余液体加回到提取板相应的微孔内。将提取板置于一斜坡位置比较适当。 |
科研用组织匀浆和细胞培养上清可按如下建议处理:细胞培养上清必须根据其培养基及其相应浓度进行处理:根据尿液样品的操作说明(至少提取20ul上清液),未稀释样品的灵敏度大概为1.0ng/ml。如果基质内添加了血清(FCS),血浆(至少提取500ul上清)操作的灵敏度可以是5pg/ml。无高氯酸的组织匀浆可用做匀浆样品,具体信息请咨询IBL汉堡公司。
9.3检测尿液和血浆中的多巴氨
1 | 在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液,轻轻振荡。 |
2 | 在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液(血浆样品孔除外)。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。将100ul提取好的血浆样品加入到相应的微孔中。在此加样步骤中,可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色,轻轻振荡。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清(紫色)。 |
4 | 盖板,在振荡器(400-600rpm)上室温(18-25℃)温育120min |
5 | 移去粘性金属板,弃取孔内反应液,每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
6 | 在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。 |
7 | 盖板,在振荡器(400-600rpm)上室温(18-25℃)温育60min |
8 | 移去粘性金属板,弃取孔内反应液,每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
9 | 如果可以的话,使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同,使用自动置换型移液器并避免气泡产生。 |
10 | 在每一微孔中加入200ul底物液。 |
11 | 在振荡器(400-600rpm)上室温(18-25℃)温育40min |
12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液,轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
13 | 加终止液后60min内405nm处读取OD值。(参考波长:620-650nm) |
10、自动操作步骤
10.1实验前说明
注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
注意 | 试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1:5的比例进行稀释(例如:20μL尿液+80μL0.1M的HCl)。标准品无需稀释。 |
10.2样品的稀释
如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释:
样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
血浆 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
尿液 | 多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
10.3样品、标准品和质控品的提取(提取板)
1) | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各30μL和750μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外,在所有的微孔中加入750μL双蒸水以消除体积差别。 |
2) | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
3) | 盖板。在轨道摇床(600-900rpm)上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中,液体的表面应该会浸湿粘性金属板,但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
4) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
5) | 每孔加入2ml双蒸水 |
6) | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上(600-900rpm)18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
7) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
8) | 每孔加入150μL提取缓冲液,再向每孔中加入50μL酰化试剂,立即混合均匀。 |
9) | 在轨道摇床(400-600rpm)上18-25℃的环境下提取20min。(无需盖板) |
10) | 快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
11) | 每孔加入2ml双蒸水。 |
12) | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上(600-900rpm)18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
13) | 移去粘性金属板,快速弃取孔内反应液,在吸水纸上拍干。 |
14) | 每孔加入450μL Release缓冲液。 |
15) | 在轨道摇床(400-500rpm)上18-25℃的环境下振荡30min。(无需盖板) |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话,您可将提取板用粘性金属板盖好,在2-8℃的环境下可存放一夜。
10.4冻干粉或浓缩成分的准备
稀释 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
25ml | 洗涤液 | 450ml | 双蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
150μL | 酶联物 | 15ml | 洗涤缓冲液(已稀释好) | 1:101 | 临时配置,仅能使用一次,混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 临时配置,仅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
11、实验步骤(自动操作)
11.1 COMT酶溶液的准备
注意:COMT酶溶液应在使用前直接临时配置 |
在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水,充分混和。再加入1.25ml酶联溶液,然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*,COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合,但要避免气泡产生,配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液,则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
11.2实验步骤
在使用自动方法做实验时,我们建议按1:10的比例预先稀释提取好的标准品、质控品和尿液样品(如果是手动操作则用Release缓冲液进行稀释)。如果稀释了,第二个步骤可简化为:将已提取好的血浆样品、已提取好的标准品(按1:10的比例预先稀释)、质控品和尿液样品各100μL加入到微孔中。在进行预稀释时,应当考虑到自动操作的死容积。
1) 在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液,轻轻振荡。
2) 在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液(血浆样品孔除外)。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。在此加样步骤中,可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色,轻轻振荡。
3) 每孔中加入50μL多巴胺抗血清。
4) 盖板。在振荡器(400-600rpm)上18-25℃的环境下温育120min
5) 弃取孔内反应液,每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。
6) 每孔加入100μL酶联物
7) 盖板。在轨道摇床(400-600rpm)上18-25℃的环境下温育60min
8) 弃取孔内反应液,用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。
9) 加底物液和终止液时,其时间间隔应相同
10) 每孔加入200μL底物液
11) 在轨道摇床(400-600rpm)上18-25℃的环境下温育40min。如果自动操作时的温度超过25℃时,则应相应的将温育时间缩短至30min。
12) 每孔加入50μL PNPP终止液以终止底物反应,轻轻振荡包被板以充分混合试剂成分。
13) 加终止液后60min之内405nm处读取OD值。(参考波长:620-650nm)
12、期望值
实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素,疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值(5%-95%),建议每个实验室读确定自己的正常值范围:
尿液 | 血浆 | |||
μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
多巴胺 | <600 | <3917 | <100 | <0.65 |
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
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