miRNA的特征、功能及识别方法等详解（三）
2) miRNA的靶基因预测方法
miRNA的研究意义之重大是毋庸置疑的。然而，与新的miRNA的频频发现相比，miRNA的功能研究相对缓慢。到目前为止，在发现的4449多个miRNA中，确定功能的miRNA仅有几十个。导致miRNA功能研究进展缓慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶标难以确定。事实上，通过实验方法确定miRNA的作用靶标非常耗时，目前尚无高通量的靶标鉴定方法。因此，通过理论方法预测miRNA的作用靶标成为当前识别miRNA作用靶标的较为理想的途径。以下重点介绍几种经典预测软件的算法分析，其他软件（表1.2）请查看相应网站
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表1.2 miRNA靶序列预测程序及查询数据库 |
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靶序列预测程序 |
适用物种 |
相关网站 |
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EMBL miRtarget prediction |
果蝇 |
http://www.russell.embl-heidelberg.de/miRNAs |
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miRanda |
果蝇，脊椎动物 |
http://microrna.org/miranda.html |
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PicTar |
脊椎动物，果蝇 |
http://pictar.bio.nyu.edu |
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TargetScan,TargetScanS |
脊椎动物 |
http://genes.mit.edu/targetscan |
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RNA hybrid |
果蝇 |
http://www.techfak.uni-bielefeld.de/persons/marc/mirna/targets |
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ViTa |
病毒 |
http://vita.mbc.nctu.edu.tv |
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miTargert |
动物 |
http://cbit.snu.ac.kr/~miTarget |
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MovingTarget |
果蝇 |
—— |
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MiRTif |
动物 |
http://mirtif.bii.a-star.edu.sg |
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miRacle |
动物 |
http://miracle.igib.res.in/miracle |
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PatScan |
植物 |
Rhoades et al. (2002) |
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microTar |
动物 |
http://tiger.dbs.nus.edu.sg/microTar |
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EIMMo |
人，果蝇，线虫，斑马鱼 |
http://www.mirz.unibas.ch/ElMMo |
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miRU |
植物 |
http://bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.html |
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DIANA-MicroT |
人，鼠 |
http://diana.pcbi.upenn.edu/DIANA-microT |
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RNA22 |
动物 |
http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html |
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MicroInspector |
动植物、病毒 |
http://mirna.imbb.forth.gr/microinspector |
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试验验证靶序列数据库 |
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mirBase |
http://www.microrna.sanger.ac.uk/targets/v2 |
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TarBase |
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase.html |
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Argonaute |
http://www.rna.uni-heidelberg.de/apps/zmf/argonaute/interface |
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miRNAMAP |
http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw |
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miRGen |
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi |
miRNA和siRNA的关系
miRNA和siRNA之间的关系令人迷惑。从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。
然而，据推测miRNAs通常是由较大的（7090 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。
两个广为人知的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解，就是说作为翻译抑制子本身不影响对应mRNA的丰度，其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以类似siRNA的方式介导目的RNA的降解。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA，包括在植物中发现的Scarecrow miRNA，能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。这提示miRNAs可以和siRNAs一样作用，这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提示siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。
一个很有趣的实验证实这个观点：Doench和同事挑选一个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在荧光素酶报告基因的3’端插入对应的CXCR4结合位点——其中一个拷贝是插入一个完全匹配的CXCR4结合位点，另一个拷贝插入4个只有3’和5’端匹配，而中间不同的CXCR4结合位点，这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点——中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入Hela细胞并用siRNA诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过10倍，RT-PCR和Northern分析证实，第一个实验的荧光素酶转录本下降了超过10倍，这正是正常的siRNA介导的RNAi反应，目标靶mRNA降解导致表达水平的下降，而第二个实验中荧光素酶转录本仅仅下降1.2倍，这种目的基因表达水平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降，而不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。实验人员还进行了另一个实验：改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果，但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——这一点和siRNA抑制的情况一样——唯一不同的是：完全匹配的结合位点（siRNA作用方式）可以单独起作用而相互不影响，而增加不完全配对的结合位点（注意在第二个实验中用了4个CXCR4结合位点）的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。
在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。
