AV-TBG-Cre/GOI在小鼠肝脏特异性基因表达敲除应用与分析
AAV-TBG-Cre/GOI系统简介:
l AAV-TBG-Cre系统是整合了肝脏特异性TBG启动子和Cre重组酶的腺相关病毒载体。
Ø TBG启动子是一种基于人甲状腺结合球蛋白(TBG)启动子和微球蛋白增强子的混合型启动子,用于肝脏特异性转外源基因表达。
Ø Cre重组酶是在P1噬菌体中发现的一种重组酶,具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的DNA序列,即LoxP位点。Cre重组酶作用于同一DNA链上两个同方向的LoxP位点时,可以有效删除两个LoxP位点之间的碱基序列,达到重组靶DNA链的目的。
Ø AAV8-TBG-Cre腺相关病毒可高效快速感染小鼠肝脏,目前被认为是最特异的肝实质细胞示踪工具。
l 此外,本公司还提供靶基因的病毒定制服务AAV8-TBG-GOI(Gene of Interest),实现外源基因在肝实质细胞中快速特异表达。
AAV-TBG-Cre/GOI的显著特点:
l 最短时间完成——仅需1-2周
l 最高效率保障——高达100%
l 最低成本实现——低于KI/KO
原理&数据:
ROSA26-loxP-Stop-loxP-YFP小鼠尾静脉分别注射1×1011 对照病毒AAV8-TBG-Blank(Control)和1×1011 AAV8-TBG-Cre病毒,一周后肝脏切片免疫组化检测YFP表达,结果显示>90%肝细胞表达YFP。
AAV-TBG-Cre/GOI相关产品& 服务:
AAV-TBG-Cre/GOI应用优势:
l 完胜基于白蛋白启动子的肝细胞特异性表达调控
表1.Alb和TBG启动子的文献数据比较
Alb-Cre和Alb-CreERT
TBG-Cre
组织/细胞特异性
Alb启动子,在肝实质细胞和前体细胞中均有转录活性。
TBG启动子,仅在成熟的肝实质细胞中有转录活性。
Alb-Cre,由于发育中肝前体细胞中有短时转录活性,其中一部分细胞可分化为胆管上皮细胞,导致部分胆管上皮细胞非特异性表现。
TBG-Cre,只在成熟肝实质细胞中表达Cre,目前被认为是肝细胞特异性敲除的金标准。
Alb-CreERT,除了在肝前体细胞内的短时转录活性外,诱导剂他莫昔芬有一定肝毒性,可引起肝细胞发生胆管反应,降低肝细胞特异性。
l 远超慢病毒和腺病毒的超高肝脏感染效率
表2. 三种病毒的参数比较
腺相关病毒载体
腺病毒载体
慢病毒载体
病毒参数
无包膜
直径20~30nm
ssDNA病毒
基因组4.6~6kb
无包膜
直径70~90nm
dsDNA病毒
基因组25~45kb
有包膜
直径90~110nm
dsRNA病毒
基因组~9kb
感染整合
不整合到宿主细胞基因组
不整合到宿主细胞基因组
随机整合至宿主细胞基因组
表达稳定性
长时间稳定表达
瞬时表达,不稳定
长时间稳定表达
安全性
低免疫原性
不整合至宿主基因组,不会诱发基因失活或激活癌基因
高免疫原性
不整合至宿主基因组,不会诱发基因失活或激活癌基因
低免疫原性
随机整合,可能导致宿主细胞基因失活或癌基因被激活
转染效率
rAAV8对肝脏感染率可达100%
小鼠肝脏感染率~60%
小鼠肝脏感染效率低。
l 力克基因打靶技术的时间成本和技术难题
表3. AAV肝脏特异性和KO/KI小鼠比较
AAV-TBG-GOI
AAV-TBG-Cre
cKO/KI
操作流程
1. 基因载体构建(简单)
2. AAV-TBG-GOI病毒制备
3. 尾静脉注射
4. 开展下游实验研究
1. 通过常规基因打靶技术获得cKI/KO小鼠
2. AAV-TBG-Cre病毒现货
3. 尾静脉注射
4. 开展下游实验研究
1. 基因载体构建(复杂,工作量大)
2. 胚胎干细胞获得
3. 同源重组,筛选阳性胚胎干细胞
4. 移植阳性胚胎干细胞至受体胚胎,得嵌合体小鼠
5. 至少经过两代遗传获得纯合体小鼠
6. 与Alb-Cre或Alb-CreERT小鼠杂交,得杂合小鼠
7. 筛选鉴定,待小鼠成年,开展下游研究
耗时
1个月获得AAV-TBG-GOI病毒,尾静脉注射后1-2周肝脏特异表达,即可开始下游实验。
1-2周即可开始下游实验
从Alb-Cre小鼠和cKI/KO小鼠杂交计算,至少需要2个月。
条件要求
极低,提供基因名称,即可获得病毒
低,有cKI/KO小鼠,直接购买病毒即可
高,必须同时有cKI/KO小鼠和Alb-Cre(ERT)小鼠
可控性
基因导入时间可控,基因表达细胞数量可通过病毒滴度控制
基因敲入/敲除时间可控,基因敲入/敲除细胞数量可通过病毒滴度控制
模型一旦构建,基因敲入/敲除立即生效,所有细胞均一化,无法控制数量和比例。
效果
肝细胞特异性表达外源基因
肝细胞特异性敲入/敲除靶基因
在肝脏敲除/敲入靶基因,特异性差(表1)
成本
低
低
高
来源:上海科远迪生物科技有限公司
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