RNA的斑点杂交
实验概要
本实验介绍了RNA的斑点杂交操作流程及注意事项。
主要试剂
1. 预杂交液：5×SSC，2×Denhardt液(或采用试剂盒的相应试剂)，0.02%(W/V) SDS
2. 杂交液DIG Easy Hyb
3. 含0.1%SDS 2×SSC和含0.1%SDS 0.1×SSC
主要设备
杂交袋
实验步骤
1. 预杂交
1) 先将预杂交液热至60℃；
2) 将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的杂交袋，加入预杂交液，按每2500px2滤膜加20ml；
3) 尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，将其置60℃水浴过夜，其间不断翻动塑料袋。
2. 杂交
1) 杂交液DIG Easy Hyb(20ml/2500px2)预温轻振荡30min；将标记探针DNA(5～25ng/ml)煮沸变性5min，迅速置冰水中冷却；
2) 加入到预温的D1G Easy Hyb(2.5ml/2500px2)中混合，避免形成气泡；
3) 探针/D1G Easy Hyb注入杂交袋中，封好杂交袋；
4) 68℃振荡孵育至少6h，在微量DNA时建议16h，使其杂交；
5) 2×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min室温；
6) 68℃振荡条件下，0.1×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次15min。
注意事项
1. 中和：尤其是计划使用硝纤膜时，凝胶中和后需查一下pH值，pH值应小于9.0，否则会导致膜变黄和破坏。尼龙膜可以承受更高的pH值。
2. 转移：最好选用尼龙膜(带正电荷)。处理膜时绝对小心，不能将指痕印在膜上，只能用无齿镊夹边角位置。
3. 固定：转膜后的DNA必须固定才能用于杂交。方法有二，其一是紫外光照射；其二是120℃烘烤30分钟(尼龙膜)或180℃真空烘烤2小时(硝纤膜)。相比之下，照射更为简便。
4. 标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头，干净器皿，每次用前必须严格清洗。操作膜时戴无尘手套；只用无齿镊操作膜的边缘。
5. 探针浓度探针浓度是非常重要的因素，应予高度重视。浓度过高会增加背景，浓度过低又会导致敏感性下降。应通过模拟杂交试验来确定最佳浓度。
6. 可用β-actin作为内参考对照。
7. 整个RNA实验中，要防止激活内源性RNase。
