褪黑激素硫酸盐ELISA试剂盒使用说明
1、应用范围
此试剂盒可用于人尿液中褪黑激素硫酸盐（又叫6-羟基褪黑激素硫酸盐和6-硫酸褪黑激素）的体外定量检测。
2、前言说明
松果体因其在光周期现象中的重要作用，已经被人们认为是神经内分泌的传感器。松果体主要分泌的激素是：N-乙酰-5-甲氧色胺和褪黑激素，褪黑激素一般是由色氨酸合成而来的。血浆褪黑激素的浓度可在夜间达到最好。褪黑激素特有的波动变化可以反映出一些关于时间变化的信息，如夜晚的长短。褪黑激素的分泌会受到神经系统的调节。交感神经系统在调节褪黑激素分泌方面发挥有重要作用，它主要是通过释放去甲肾上腺素来调节的。据报道，褪黑激素分泌方式和水平的变化与人的一些生理状态一致，如：失眠、时差感、情绪低落、压力大、精神分裂症、丘脑下部性闭经、妊娠、神经想食欲缺乏、某些癌症、免疫系统紊乱和青春期性成熟的影响。大多数循环褪黑激素都可在肝内代谢成6-羟基褪黑激素，之后变成6-硫酸褪黑激素而随尿液排除。尿液中6-羟基褪黑激素硫酸盐的浓度与血液中褪黑激素的总水平有很好的相关性。
3、实验原理
此ELISA试剂盒利用的是竞争法的原理。样品中未知量的抗原和一定量的酶标抗原竞争性结合到包被在微孔中的抗体结合位点上。温育后洗板以终止竞争反应。加入底物液后，溶液所显示的颜色强度与样品中抗原的量成反比。样品的实验结果可以从标准曲线上直接获取。
4、储存与稳定性
试剂盒必须在2-8℃的环境下运输和储存，避免太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂准备将在相关章节中阐述。如果将包被板密封并储存于2-8℃的环境下时，试剂在有效期内稳定。
5、样品的采集与储存
尿液
实验必须使用自然产生的尿液，也可使用24小时内产生的尿液。收集病人24小时内产生的尿液，将它加入到含10-15ml 6N HCl防腐剂的容器中。为了计算结果，请确定尿液的总体积。实验开始前请先将样品离心。 | |||
储存 | 2-8℃ | 2-8℃ | 避免太阳直射，避免反复冻融 |
稳定性 | 4天 | 15年 |
6、试剂盒成分
数量 | 标记 | 成分 |
1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，多克隆）。 |
1×5ml | ANTISERUM | 褪黑激素硫酸盐抗血清，即用，内含：兔抗血清、Tris缓冲液和0.01%的硫柳汞 |
1×0.2ml | ENZCONJ CONC | 酶联物，40倍浓缩，内含过氧酶标记的褪黑激素硫酸盐、Tris缓冲液和1%的硫柳汞。 |
1×7×0.1ml | CAL A-G | 标准品A-G，0;1.7; 5.2; 15.6; 46.7; 140; 420ng/mL 0;5.2;15.9;47.6;142;427;1281nmol/L。即用，内含褪黑激素硫酸盐、Tris缓冲液和0.01%的硫柳汞。 |
1×2×0.1ml | CONTROL 1+2 | 质控品1+2，即用，内含0.02%的；硫柳汞。具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签。 |
1×60ml | ASSAYBUF CONC | 检测缓冲液，红色，即用，内含Tris缓冲液、BSA和0.01%的硫柳汞。 |
1×50ml | WASHBUF CONC | 洗涤液，20倍浓缩，内含磷酸缓冲液、吐温和0.1%的硫柳汞。 |
1×0.9ml | TMB SUBS CONC | TMB底物液，31倍浓缩，内含TMB、缓冲液和稳定剂。 |
1×27ml | TMB缓冲液 | TMB底物缓冲液，储存时避免太阳直射，即用，内含H2O2、柠檬酸盐缓冲液和稳定剂。 |
1×12ml | TMB STOP | TMB终止液，即用，1M的H2SO4。 |
3× | FOIL | 粘性金属板 |
7、实验所需器材但试剂盒不提供
1）移液器，体积：10; 50; 100; 1000ul
2）试管（12×75mm）
3）试管架
4）振荡器（500rpm）
5）旋涡混合器（500rpm）
6）带储器的8道移液器
7）洗涤瓶，自动或半自动洗板机
8）酶标仪（参考波长：600-650nm）
9）蒸馏水或去离子水
10） 吸水纸、取样吸头和计时器
8、实验前的准备说明
8.1冻干或浓缩成分的准备
稀释/溶解 | 成分 | 稀释剂 | 比例 | 备注 | 储存 | 稳定性 | |
15ml | 洗涤液 | 300ml | 双蒸水 | 1：20 | 18-25℃将晶体溶解掉 | 2-8℃ | 4周 |
50ul | 酶联物 | 2ml | 检测缓 冲液 | 1:41 | 临时配置,只能使用一次 | 18-25℃ | 30min |
300ul | TMB底物 液 | 9ml | TMB底物 缓冲液 | 1：31 | 临时配置,只能使用一次 | 18-25℃ | 10min |
8.2标准品、质控品和病人尿液样品的稀释
1 | 将标准品、质控品和病人尿液样品分别10ul加入到聚苯乙烯或聚丙烯或玻璃试管中，避免太阳直射。 |
2 | 在每一试管中加入500ul检测缓冲液，旋涡混合。 |
褪黑激素硫酸盐浓度高于最高标准品浓度的样品必须用检测缓冲液进行进一步的稀释。
9、实验步骤
1 | 将已稀释好的标准品、质控品和病人样品分别50ul加入到相应的微孔中。 |
2 | 在每一微孔中加入50ul临时配置好的酶联物。 |
3 | 在每一微孔内加入50ul褪黑激素硫酸盐抗血清。 |
4 | 盖板，室温（18-25℃）包被板振荡器（500rpm）温育2小时。 |
5 | 在温育快要结束的10分钟前，请将TMB底物液准备好。 |
6 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干以除出残余液体。 |
7 | 如果可以的话，请用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用 |
8 | 在每一微孔中加入200ul TMB底物液。 |
9 | 室温（18-25℃）包被板振荡器（500rpm）温育30min。 |
10 | 在每一微孔中加入100ul TMB终止液，轻请振板以混合溶液。 |
11 | 加终止液后60min内在450nm处读取OD值。 |
10、期望值
实验结果不能当作确定治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下为明显正常人群褪黑激素硫酸盐的正常值：
年龄 | 数目 | 褪黑激素硫酸盐 | |||
24小时尿液（ug） | 夜间尿液（ug/h） | ||||
平均值 | 90%的比例 | 平均值 | 90%的比例 | ||
20-35 | 26 | 36.8 | 15.6-58.1 | 2.8 | 0.9-5.6 |
36-50 | 17 | 29.6 | 9.9-52.9 | 2.1 | 0.6-3.6 |
51-65 | 16 | 20.4 | 12.3-32.8 | 1.5 | 0.9-2.5 |
＞ | 16 | 15.8 | 7.5-32.7 | 1.0 | 0.3-2.3 |
建议每个实验室读确定自己的正常值范围
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
