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细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂...

2020.5.11

细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒使用说明

产品说明书（中文版）

主要用途

细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP或AMP波峰，以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。

产品内容

酸性液（Reagent A） 5毫升

中和液（Reagent B） 1毫升

流相液A（Reagent C） 500毫升

流相液B（Reagent D） 500毫升

标准液（Reagent E） 500微升

产品说明书 1份

保存方式

保存标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent A）和中和液（Reagent B）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

样品准备

准备好待测细菌样品
进行细菌计数：在分光光度仪上测定OD600或直接计数
转移到预冷的1.5毫升离心管
放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
加入200微升预冷的酸性液（Reagent A）
涡旋震荡1分钟
转移到1.5毫升离心管
放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g
小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
加入31微升中和液（Reagent B），充分混匀
置于冰槽里静置30分钟
即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）
放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测

二、测定准备

开启仪器预热15分钟
根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数

参数	推荐	补充说明
色谱柱	长度：25cm 直径：4.6mm	Waters仪器或 Agilent仪器
固定相	ODS
流动相	流相液A（Reagent C）和流相液B（Reagent D）	参见运行程序
流速	1.3毫升/分钟
注射容量	50微升	10微升至100微升
检测	紫外
波长	254nm
柱温	25℃
出峰时间（retention）	5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)	参考
运行时间	15分钟	参考

运行程序

运行时段	程序	时间
开机后预运行	100% 流相液A（Reagent C）	总10分钟
检测运行时段	100% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D）	0至9分钟
100% 流相液A（Reagent C）至 75% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D）至25%流相液B（Reagent D）	9至15分钟
关机前运行	100% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D）	总10分钟

标准样品配制

准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
分别加入100微升流相液A（Reagent C）到1至5号管
移取100微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀
小心移取100微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀
小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀
小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀
将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号	流相液A（Reagent C）	标准液（Reagent E）	标准ATP/ADP/AMP浓度
1	100微升	100微升	100微摩尔/升
2	100微升	100微升1号管	50微摩尔/升
3	100微升	100微升2号管	25微摩尔/升
4	100微升	100微升3号管	12.5微摩尔/升
5	100微升	0	0