细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂盒
细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂盒
产品说明书(中文版)
主要用途
细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理,碱性中和后,在高效液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP或AMP波峰,以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
腺嘌呤核苷酸(adenine nucleotides),简称腺苷,包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷,是一种单体单位,为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的组成成分,并提供化学能量,在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能,调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低,且不稳定,通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况,来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate;AMP),又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸(5'-adenylic acid),是一种在(脱氧)核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯,并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P,分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶(adenylate kinase)催化2分子ADP生成,或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸(cAMP)形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷(adenosine diphosphate;ADP),参与ADP-ATP循环,提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate;ATP)存在于所有代谢活跃的细胞内,是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死,ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理,排除蛋白质干扰,碱性中和后,在高效液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP、AMP波峰,以定量其含量。
产品内容
酸性液(Reagent A) 5毫升
中和液(Reagent B) 1毫升
流相液A(Reagent C) 500毫升
流相液B(Reagent D) 500毫升
标准液(Reagent E) 500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存标准液(Reagent E)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;酸性液(Reagent A)和中和液(Reagent B)具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
4℃(微型)台式离心机:用于样品操作
高效液相色谱仪(HPLC):用于定量测定
实验步骤
样品准备
准备好待测细菌样品
进行细菌计数:在分光光度仪上测定OD600或直接计数
转移到预冷的1.5毫升离心管
放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415)
小心抽去上清液,保留沉淀颗粒
加入200微升预冷的酸性液(Reagent A)
涡旋震荡1分钟
转移到1.5毫升离心管
放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟,速度为6000g
小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
加入31微升中和液(Reagent B),充分混匀
置于冰槽里静置30分钟
即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管(注意:避免移取沉淀颗粒)
放进-70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测
二、测定准备
开启仪器预热15分钟
根据下表设置高效液相色谱仪(HPLC)参数
参数
推荐
补充说明
色谱柱
长度:25cm
直径:4.6mm
Waters仪器或
Agilent仪器
固定相
ODS
流动相
流相液A(Reagent C)和流相液B(Reagent D)
参见运行程序
流速
1.3毫升/分钟
注射容量
50微升
10微升至100微升
检测
紫外
波长
254nm
柱温
25℃
出峰时间(retention)
5.6分钟(ATP);6.5分钟(ADP);10分钟(AMP)
参考
运行时间
15分钟
参考
运行程序
运行时段
程序
时间
开机后预运行
100% 流相液A(Reagent C)
总10分钟
检测运行时段
100% 流相液A(Reagent C)
0%流相液B(Reagent D)
0至9分钟
100% 流相液A(Reagent C)至
75% 流相液A(Reagent C)
0%流相液B(Reagent D)至25%流相液B(Reagent D)
9至15分钟
关机前运行
100% 流相液A(Reagent C)
0%流相液B(Reagent D)
总10分钟
标准样品配制
准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
分别加入100微升流相液A(Reagent C)到1至5号管
移取100微升标准液(Reagent E)到1号管,混匀
小心移取100微升1号管稀释的标准液(Reagent E)到2号管,混匀
小心移取100微升2号管稀释的标准液(Reagent E)到3号管,混匀
小心移取100微升3号管稀释的标准液(Reagent E)到4号管,混匀
将1至5号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表
管号
流相液A(Reagent C)
标准液(Reagent E)
标准ATP/ADP/AMP浓度
1
100微升
100微升
100微摩尔/升
2
100微升
100微升1号管
50微摩尔/升
3
100微升
100微升2号管
25微摩尔/升
4
100微升
100微升3号管
12.5微摩尔/升
5
100微升
0
0
四、色谱分析
将上述配制的标准液(Reagent E)和待测样品放进冰槽里等待
每次(每个样品)注射50微升
按照检测运行程序每次(每个样品)运行15分钟
获得色谱波峰图:波峰面积(peak area)或峰值,保存记录
五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度
方法一:通过仪器中的软件进行测算
方法二:构建标准曲线:纵座标(Y轴)为波峰面积(peak area);横座标(X轴)为标准ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升),根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升)
方法三:公式计算(选择单一浓度的标准液)
样本ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升)=【样本波峰面积(peak area)X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积
注意事项
本产品为25次操作,包括标准液
操作时,须戴手套
系统操作过程中,标准液测定只需1次
试剂具有挥发性,注意密闭瓶盖或使用封口膜
酸性液(Reagent A)和中和液(Reagent B)具有腐蚀性,注意操作安全
建议使用流相液A(Reagent C)作为阴性对照或作为基准线
色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等
用户可以使用已知浓度的标准液(Reagent E)作为内参标准加入到样品中,然后进行萃取,检测回收率(recovery)
腺嘌呤核苷酸的出峰时间(retention)以用户操作时,使用的标准液(Reagent E)实际出峰为准
用户可以根据要求,计算实际浓度为:纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等
如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下:
本公司提供系列腺嘌呤核苷酸检测试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感
来源:上海一基实业有限公司
联系电话:021-61119791
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