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细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂盒

2020.8.25

  细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂盒

  产品说明书(中文版)

  主要用途

  细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法(HPLC)定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理,碱性中和后,在高效液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP或AMP波峰,以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

  技术背景

  腺嘌呤核苷酸(adenine nucleotides),简称腺苷,包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷,是一种单体单位,为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的组成成分,并提供化学能量,在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能,调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低,且不稳定,通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况,来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate;AMP),又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸(5'-adenylic acid),是一种在(脱氧)核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯,并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P,分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶(adenylate kinase)催化2分子ADP生成,或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸(cAMP)形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷(adenosine diphosphate;ADP),参与ADP-ATP循环,提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate;ATP)存在于所有代谢活跃的细胞内,是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死,ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理,排除蛋白质干扰,碱性中和后,在高效液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP、AMP波峰,以定量其含量。

  产品内容

  酸性液(Reagent A) 5毫升

  中和液(Reagent B) 1毫升

  流相液A(Reagent C) 500毫升

  流相液B(Reagent D) 500毫升

   标准液(Reagent E) 500微升

  产品说明书 1份

  保存方式

  保存标准液(Reagent E)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;酸性液(Reagent A)和中和液(Reagent B)具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证6月

  用户自备

  1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

  4℃(微型)台式离心机:用于样品操作

  高效液相色谱仪(HPLC):用于定量测定

  实验步骤

  样品准备

  准备好待测细菌样品

  进行细菌计数:在分光光度仪上测定OD600或直接计数

  转移到预冷的1.5毫升离心管

  放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415)

  小心抽去上清液,保留沉淀颗粒

  加入200微升预冷的酸性液(Reagent A)

  涡旋震荡1分钟

  转移到1.5毫升离心管

  放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟,速度为6000g

  小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

  加入31微升中和液(Reagent B),充分混匀

  置于冰槽里静置30分钟

  即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管(注意:避免移取沉淀颗粒)

  放进-70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测

  二、测定准备

  开启仪器预热15分钟

  根据下表设置高效液相色谱仪(HPLC)参数

  参数

  推荐

  补充说明

  色谱柱

  长度:25cm

  直径:4.6mm

  Waters仪器或

  Agilent仪器

  固定相

  ODS

  流动相

  流相液A(Reagent C)和流相液B(Reagent D)

  参见运行程序

  流速

  1.3毫升/分钟

  注射容量

  50微升

  10微升至100微升

  检测

  紫外

  波长

  254nm

  柱温

  25℃

  出峰时间(retention)

  5.6分钟(ATP);6.5分钟(ADP);10分钟(AMP)

  参考

  运行时间

  15分钟

  参考

  运行程序

  运行时段

  程序

  时间

  开机后预运行

  100% 流相液A(Reagent C)

  总10分钟

  检测运行时段

  100% 流相液A(Reagent C)

  0%流相液B(Reagent D)

  0至9分钟

  100% 流相液A(Reagent C)至

  75% 流相液A(Reagent C)

  0%流相液B(Reagent D)至25%流相液B(Reagent D)

  9至15分钟

  关机前运行

  100% 流相液A(Reagent C)

  0%流相液B(Reagent D)

  总10分钟

  标准样品配制

  准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管

  分别加入100微升流相液A(Reagent C)到1至5号管

  移取100微升标准液(Reagent E)到1号管,混匀

  小心移取100微升1号管稀释的标准液(Reagent E)到2号管,混匀

  小心移取100微升2号管稀释的标准液(Reagent E)到3号管,混匀

  小心移取100微升3号管稀释的标准液(Reagent E)到4号管,混匀

  将1至5号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表

  管号

  流相液A(Reagent C)

  标准液(Reagent E)

  标准ATP/ADP/AMP浓度

  1

   100微升

  100微升

  100微摩尔/升

  2

  100微升

  100微升1号管

  50微摩尔/升

  3

  100微升

  100微升2号管

  25微摩尔/升

  4

  100微升

  100微升3号管

  12.5微摩尔/升

  5

  100微升

  0

  0

  四、色谱分析

  将上述配制的标准液(Reagent E)和待测样品放进冰槽里等待

  每次(每个样品)注射50微升

  按照检测运行程序每次(每个样品)运行15分钟

  获得色谱波峰图:波峰面积(peak area)或峰值,保存记录

  五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度

  方法一:通过仪器中的软件进行测算

  方法二:构建标准曲线:纵座标(Y轴)为波峰面积(peak area);横座标(X轴)为标准ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升),根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升)

  方法三:公式计算(选择单一浓度的标准液)

  样本ATP/ADP/AMP浓度(微摩尔/升)=【样本波峰面积(peak area)X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积

  注意事项

  本产品为25次操作,包括标准液

  操作时,须戴手套

  系统操作过程中,标准液测定只需1次

  试剂具有挥发性,注意密闭瓶盖或使用封口膜

  酸性液(Reagent A)和中和液(Reagent B)具有腐蚀性,注意操作安全

  建议使用流相液A(Reagent C)作为阴性对照或作为基准线

  色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等

  用户可以使用已知浓度的标准液(Reagent E)作为内参标准加入到样品中,然后进行萃取,检测回收率(recovery)

  腺嘌呤核苷酸的出峰时间(retention)以用户操作时,使用的标准液(Reagent E)实际出峰为准

  用户可以根据要求,计算实际浓度为:纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等

  如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

  腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下:

  本公司提供系列腺嘌呤核苷酸检测试剂产品

  质量标准

  本产品经鉴定性能稳定

  本产品经鉴定检测敏感

  来源:上海一基实业有限公司

  联系电话:021-61119791

  E-mail:2851717098@qq.com


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