ChIP实验技术经验分享
染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是研究活体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。
ChIP的原理
把生理状态下的细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，然后可进行后续的DNA序列测序鉴定等。
ChIP实验步骤
ChIP经验分享
ChIP实验操作性很强，金开瑞根据多年的实践，总结了一些ChIP实验中您可能会遇到的棘手的问题，下面我们就一起来分享一下吧！
细胞固定
1、甲醛终浓度为1%较适宜；
2、固定时间一般为5-60min较好，具体时间根据实验而定。；
染色质断裂
超声时断时续，保证低温；
注意探头位置，防止产生泡沫；
研究组蛋白需使用酶处理；
染色质免疫沉淀
最好有Input对照，Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
抗体的选择是关键。抗体的选择要注意三点：一是应该选择能够做ChIP实验的抗体。尽量选择ChIP级别商业化的抗体。如没有，一般可以重组到带有标签的载体上，再转染相应的宿主（目前市面上商业化的chip抗体只有300多种，因此正好找到对应抗体较困难，可以选择标签抗体）。二是抗体的结合位点。选择单抗的话，尽量远离抗原和染色质相结合的位点，这样可以最大限度保证抗体和抗原的结合，而多抗可识别多个表位，可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点，应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。三是抗体的浓度。抗体浓度的也很重要，浓度太低，不能与靶蛋白完全结合。浓度太高会导致非特异性条带增加背景。
阴性对照可以使用血清或lgG，阳性对照一般使用RNA Polymerase II或者组蛋白。
阴性对照：用实验抗体同型的IgG作为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阴性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带。如果阴性对照样品中的产物量等于特异靶标样品中产物量，说明特异靶标抗体未发挥作用或者染色质断裂不充分。
阳性对照：为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（组蛋白）抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。因此，理论上ChIP后PCR都会有条带。
需设计已经确定的、不与特异抗原相结合的DNA片段的引物，用来排除抗原和染色质的非特异结合。
交联反应的逆转
RNA酶、蛋白酶需65℃保温6小时
不加蛋白酶可以提取、分析结合蛋白
DNA的纯化
最好用试剂盒，便于后面的PCR检测
DNA的鉴定
1、可以进行二代测序或者QPCR检测结果
因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。如果ChIP实验方面有什么问题，欢迎与我们交流哦！
来源：武汉金开瑞生物工程有限公司
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