大鼠肝细胞生长因子(HGF)定量检测试剂盒使用说明
【产品名称】
通用名称：大鼠肝细胞生长因子(HGF)定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称：Rat hepatocyte growth factor(HGF)ELISA KIT
【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中大鼠肝细胞生长因子(HGF)的浓度。
【检验原理】
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗大鼠肝细胞生长因子(HGF)抗体（固相抗体，货号：INS102027C）的微孔酶标板中，加入大鼠肝细胞生长因子(HGF)标准品（货号：INS102027J）、待测样本和生物素化的检测抗体（货号：INS102027K）。经过孵育，样本中存在的 HGF与固相抗体和检测抗体结合。经过洗涤去除未结合的组分，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。洗涤后，加入显色底物 TMB，避光显色。底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色。在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中大鼠肝细胞生长因子(HGF)的浓度正相关。拟合标准品曲线，可以计算出样本中大鼠肝细胞生长因子(HGF)的浓度。
【主要组成成分】
主要成分
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组分 |
48T规格 |
96T规格 |
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标准品 |
1 vial |
2 vial |
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预包被酶标板 |
96T |
48T |
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检测抗体 |
1 vial |
1 vial |
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标准品稀释液 |
5 ml |
5 ml |
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HRP标记的链霉亲和素 |
1vial |
1vial |
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10×检测缓冲液 |
5 ml |
5 ml |
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显色底物 TMB |
10 ml |
10 ml |
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终止液 |
10 ml |
10 ml |
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20×浓缩洗涤液 |
30mL |
30mL |
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说明书 |
1份 |
1份 |
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自封袋 |
1个 |
1个 |
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封板膜 |
3片 |
3片 |
需要但未提供的材料及耗材
1、能够检测 450 nm 吸光度的酶标仪，参考波长 570 nm 或 630 nm。
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水或去离子水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、1L量筒
7、无粉一次性乳胶手套
8、稀释用聚丙烯试管
【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为28天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。
【适用仪器】
半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。
【样本要求】
样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
【试剂准备】
检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。
如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。
1×洗液
吸取 20×浓缩洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸馏水或去离子水至 1000 ml，轻轻混匀，避免泡沫。
转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存，1×洗液可稳定 30 天。
1×检测缓冲液
吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸馏水或去离子水至 50 ml，轻轻混匀，避免泡沫。
2 - 8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。
检测抗体
稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的检测抗体。
注意：请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素
稀释前充分混匀。
根据标准品和待测样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1：100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
注意：请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
样本稀释
如果样本需要稀释，请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释细胞培养上清
大鼠HGF标准品
用蒸馏水或去离子水重溶大鼠HGF标准品，重溶体积标注在大鼠 HGF 标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为 4000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释前充分混匀。
请使用聚丙烯管进行标准品稀释。
血清/血浆样本标准曲线的制作：
取 200μl 浓缩的大鼠 HGF 标准品，加入 200 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入200 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。
细胞培养上清样本标准曲线的制作：
取200μl浓缩的人大鼠 HGF标准品，加入 200 μl 细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 200 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。
4000 pg/ml
操作程序
1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品按前面试剂准备中描述的方法配置好，并建议做复孔。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3.加入 350 μl 1×洗液静置浸泡25 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后， 在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。
4.每孔加入 50 μl 1×检测缓冲液（本步骤某些指标的产品可能有所改动）。
5.复孔加入 50 μl 2 倍倍比稀释的标准品，空白孔复孔加入 50 μl 标准品稀释液。样本孔加入 50 μl样本（本步骤某些指标的产品可能有所改动）。
6.每孔加入 50 μl 稀释的检测抗体。保证步骤 4、5、6 连续加样，不要间断。加样过程在 10 分钟内完成。
7.使用封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 2 小时。
8.弃掉液体，每孔加入 350 μl 洗液洗板，洗涤 5 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。
9.每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
10.使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 45 分钟。
11.重复步骤 8。
12.每孔加入 100 μl 显色底物 TMB，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。
13.每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。
14.在 15分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定 450 nm 最大吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高，并且准确度降低
【检验结果的解释】
计算标准品和样本的平均 OD 值，然后减去零浓度标准品的 OD 值。
检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，回归分析确定最佳拟合曲线，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度
【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于标准曲线最高浓度，请用检测缓冲液稀释样本，并重新检测。如果细胞培养上清样本需要较大的稀释倍数，请用细胞培养基进行适度稀释。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
【产品性能指标】
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。
4、灵敏度
最低检出剂量小于12.5pg/ml。
5、回收率
三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。
6、特异性
本试剂盒识别天然和重组大鼠肝细胞生长因子(HGF)，与结构类似物无交叉。
7、稳定性
2℃-8℃保存，有效期6个月。
【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
4、试剂盒中的终止液为酸性溶液，在使用终止液时，请佩戴防护服，及防护眼睛、手及面部的设施。
5、本试剂盒用于科学研究，不能用于诊断治疗。
6、请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。
技术要点
1、重溶或者混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加标准品与样本时，每个标准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。
