采用PACE分析RNA-肽相互作用实验
实验方法原理 聚丙烯酰胺共电泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或 RNA 相互作用的方法。
实验材料 低放射性标记物RNA 底物
试剂、试剂盒 TBE 凝胶储存缓冲液电泳缓冲液丙烯酰胺储存液过硫酸铵考马斯亮蓝
仪器、耗材 聚丙烯酰胺凝胶电泳设备PACE 凝胶层析纸塑料膜凝胶干燥器暗盒
实验步骤
一、材料与设备
1. 标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备，包括电源、电泳槽、夹子、热槽（1/8 英寸厚的铝板）。
2. 宽而短的凝胶，因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度，短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量，一般尺寸为 24 cm X 36 cm 或 26 cm X 36 cm( h X w )，凝胶的实际尺寸并不是至关重要的，在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。
3. 针对 PACE 凝胶，梳子和垫片要进行一定的切割，如图 11.5 所描述对梳子和垫片进行切割，切割以后的凝胶可以包括 10 个肽浓度。
4. 10 ml Luer 注射器，25 gage 针头，手套和石蜡膜。
5. 低放射性标记物。
6. 层析纸，塑料膜和凝胶干燥器。
7. 暗盒，X 射线片和显影剂。
8. 放射物质定量仪器。
9. 5X TBE 凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液：450 mmol/L Tris 碱，450 mmol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
10. 40% 丙烯酰胺储存液（29：1，丙烯酰胺：甲叉甲双丙烯酰胺）。
11. 10% 过硫酸铵（API 水溶液（m/V），99% TEMED。
12. 32P 标记的 RNA 底物，PACE 可以使用 3'，5' 或者内部标记的 RNA。可以采用标准的程序制备 RNA 样品，如果仅有痕量浓度的 RNA 上样到 PACE 凝胶，则要求高的放射活性（> 200 dμm/fmol）。
13. 制备并纯化肽或者蛋白。因为 PACE 测定非常敏感，高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求，一般采用反向高效液相色谱（PR-HPLC）或其他的高精度的纯化方法进行纯化，蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为 100X，在使用时稀释 100 倍。
14. RNA 样品稀释到 6X 的 Ⅲ 型上样染料中：0.24% 溴酚蓝，0.24% 的二甲苯青 FF，30% 的甘油水溶液。
15. 考马斯亮蓝蛋白染色：0.24% 考马斯亮蓝，45% 甲酵的 10% 冰醋酸水溶液，用来标定 PACE 电泳的时间。
二、试验方法
1. 检测
(1) 用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净，然后再用乙醇淋洗，理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图 11.6 所示安装凝胶板、梳子和垫片，将其旋转 90°。滑动取出上部的垫片（S）创造一个灌胶的空隙，在 B 和 P 相对的毎个缺口的顶部之间画线，标定每个肽浓度凝胶的灌注高度，标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。
(2) 制备 200 ml 凝胶混合物：0.5X TBE，15% ( 29：1）丙烯酰胺，0.02% 的过硫酸铵（20 ml 5X TBE 储存液，75 ml 40% 的丙烯酰胺储疗液，400 μl 10% 的 AP，104.6 ml 重蒸水）。使用时添加盐（Na+，K+，Mg2+ 等）、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合，使用真空抽气机进行脱气，直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂，要在脱气以后加入，凝胶混合物终体积为 200 ml。
(3) 去除注射器的活塞，用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直，加入 70.7 μl 100X 肽储存液（或缓冲液，在肽浓度为 0 的凝胶条使用），加入 7 ml 的凝胶混合物，14 μl 的 TEMED，用手指紧紧的封住针筒的末端，将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置，将注射器倒转使针孔向上，让气泡升到上部，移开手指和石蜡膜，不要将注射器指向自己，因为可能会有少量的凝胶混合物喷出，推动活塞直到它完全进入针筒内，然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物，移幵手指推动活塞使气体溢出针筒，直到凝胶混合物刚好要溢出。
(4) 安装 21 gage 针头，缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间，直到凝胶达到第一个切口之间的画线。
(5) 等待 10 min 以便凝胶进行聚合，在等待的同时，取出注射器，丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用，注意要确保没有残留的水。
(6) 凝胶聚合完成后，用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的 Whatman 纸在两个板中间滑动，吸出上层的未聚合的凝胶溶液。
(7) 重复步骤 (4)~(6)，依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为 1~8 的凝胶条。
(8) 减少凝胶底部与垫片 S 之间的空隙并灌注最后的凝胶条（ 标号为 9）。倾斜装置，以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子，等 10 min 以便凝胶聚合。
(9) 如图 11.7 将装置放平，在灌胶梳子一端稍抬起（大约 5 cm）。去除凝胶梳子，用 Whatman 纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。
(10) 配制 7 ml 肽浓度为 0 的凝胶混合物，加入 14 μl TEMED，然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘，再加入 1 ml TEMED，插入梳子，聚合 15 min。
(11) 去除底部的垫片及梳子，将灌好的胶装到电泳槽。
(12) 在电泳槽中加入 0.5% TBE 缓冲液（添加盐或去污剂），洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙，不必进行预电冰，将 RNA 样品加到适当的上样孔，上样孔一般只能上 2 μl 的样品。
(13) 凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳，以尽量减少热的产生，21 cm X 36 cm 大小，0.8 mm 厚的凝胶在 3W 的条件下（不考虑盐的浓度）可以得到好的分离效果，电泳的吋间控制在 RNA 和肽刚好不跑出凝胶。
(14) 电泳结束后取下凝胶装置，移去一块电泳玻璃板，用塑钭膜盖住凝胶，在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度，将凝胶从另一个板上剥离，转移到塑料膜上，用 Whatman 纸覆盖凝胶。
(15) 在凝胶干燥器里干燥 1 h，粘上两点发光的标签作为参照，凝胶对底片曝光适当的时间。
(16) 进行底片显影，使其干燥，利用发光标签将凝胶和底片对齐，在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记，测量从该处到每个条带中央的距离，或者是到条带底部的距离 ( 条带有拖影或者跨越了两个道的分界时），重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。
