单抗生产工艺的发展趋势（一）
目前单抗是最成功的一类生物制品。批准上市的单抗数量已超过50种，到2020年销售额有望超过1250亿美元。能够与特定靶点结合的高度特异性和亲和能力，以及目的蛋白序列易于人源化和全人源化的特性导至这类生物制品的爆炸性增长。最近20年该类产品发展迅猛，目前已有超过300种单抗处于临床试验阶段。单抗已被批准广泛用于恶性肿瘤、免疫学疾病和罕见病等多个适应症。
除了与目标细胞表面靶点的高度特异性结合能力之外，快速开发出强健的生产工艺将单抗候选产品推进临床试验阶段的能力也成为单抗项目顺利推进的关键因素。单抗生产的便捷性和速度使这些候选产品的快速进入临床试验，这些工艺的可扩展性和稳健性可极大地促进了大规模的商业化生产。
蛋白质生产工艺的开发时需要考虑到多个方面，包括杂质去除、稳健性、可扩展性以及使用易于获得的大量供应的原材料。工艺能力不仅要考虑满足早期临床试验所需的规模，也要考虑支持长期供应的需求和规模。因此，充分利用平台方法是开发生产工艺的关键。稳健性、可扩展性和可重复性的水平意味着这些生产工艺看起来与用于实验室纯化少量蛋白的工艺存在明显差异。工艺开发是一项耗时的工作，需要进行大量的试验。因此，只要情况允许，工业界都会倾向于采用平台方法。
从商业角度看，平台方法具有明显的优势。进入临床的速度通常是决定公司成败的关键因素。单抗平台可以在一年之内将项目从基因设计阶段推进到IND阶段，这对于通常需要2年时间进行开发的分子项目来说是一个巨大的进步。减少的试验也意味着研发成本的降低。工艺平台的可预测性使诸如生产和质量控制这样的组织能够采用模板化的文档集，这也减少了在生产和放行检测上花费的时间和资源。单抗的工艺平台使得从启动临床试验一直到产品商业化的全过程生产工艺变得高效和稳健。平台方法的一致性和可预测性极大地促进了这类产品的发展。
单抗非常尤其适用于平台方法的应用。采用成熟的哺乳动物细胞培养系统，可快速和模板化的方式开发稳定的细胞系。已有几个经过优化的表达载体专用于单抗的生产。也有适用于单抗的稳健的流加培养工艺。其中的一些细胞系和培养工艺已用于大规模生产，并深入表征了影响这些工艺的操作参数。细胞系开发和上游细胞培养工艺非常适合采用模板化的方法。然而，对于大多数蛋白质来说，最大的差异是下游纯化工艺，应根据蛋白特性和关键杂质为每种蛋白质设计个性化的纯化工艺。单抗的Fc区能高度特异性的与蛋白A结合，后者是金黄色葡萄球菌的细胞壁组成部分。蛋白质亲和层析法已被广泛应用于单抗生产，层析方法几乎不需要优化即可达到95%以上的纯度。蛋白质A层析后的主要挑战是去除残留的宿主细胞蛋白，高分子量聚合，DNA以及去除病毒污染的能力。领先的生物制药公司已经开发了一些用于生产单抗的下游工序平台。与不能在下游工艺中包含关联步骤的其他蛋白质项目相比，从模板中使用通用的起始方法的能力，可以减少相应的实验数量。
这些下游工艺平台已经成功地使大量的单抗产品进入了临床和商业领域。然而，目前仍有一些新兴趋势在继续塑造生物制药行业。下一节将就领导者的对单抗生产工艺面貌的改变趋势进行讨论。
许多因素正在推动传统生物制药生产的改变，因为药物的销售价格是由病人的生命和健康的价值决定的，生产成本不被认为是一个重要因素。其结果是，生产成本成为日益关注的焦点。此外，具有生产能力的组织正在寻求更有效地利用现有的工厂，以减少对新工厂建设的需求。在推动工艺创新的背景下，许多因素都被进行检验。
2.1 生物类似药
生物仿制药(一般又被成为生物类似药)的出现是传统生物制药方式的关键改变。
尽管由于自身的复杂性，生物类似药的价格下降并不像小分子药物那样显著，但生物仿制药的焦点仍集中在生产成本上。2005年10月30日，欧盟颁布了“生物类似药品指导原则”。此后，许多大型生物技术公司和大型制药公司宣布成立生物仿制制药公司，其中包括山德士、安进、Biogen(属于三星)、辉瑞和默克雪兰诺公司，预计到2020年生物类似药的市场规模将近200亿美元。美国FDA在接受生物相似药的应用方面更加谨慎，目前已经批准了两种产品， Zarxio(Neupogen生物相似药)和Inflectra (Remicade生物相似药)。而截止至2016年5月，EMA已经批准了22个生物类似药。随着这一趋势在全球范围内不断扩大，生物类似药将显著降低商品成本(COGS)。
2.2 全球化生物制药
随着生物类似药的兴起，人们对全球化生物制药的兴趣也越发浓厚。这也与几个市场对在生物制药本土企业给予优惠待遇有关。中国的情况尤为明显，辉瑞和通用电气联合推出了一种生物类似药生产工厂，名为KU Bio。其他生物制药企业也进入了包括无锡在内的中国市场。2015年12月，中国食品药品监督管理总局(cFDA)宣布，中国将加快药品上市申请的审批程序。在拉丁美洲和南非，生物类似药的本土化生产趋势也开始高涨起来。一系列从事生物药生产的印度公司数量也有明显增长。
2.3. 一次性生产技术
一次性生产技术的增长推动了全球化的生产，这种技术显著降低了基础建设投资。一次性生产技术使全程采用用后即弃的方式迅速用于生产临床样品成为可能。生物制药的一次性生产是一种趋势，现已发展到商业制造领域，已有几家生产厂家先后使用了多个2000L一次性生物反应器来生产生物制药。如安进公司在新加坡的制造工厂利用6×2000L的一次性生物反应器来进行细胞培养。与目前仍处于主导地位的大型不锈钢设备相比，这些技术使生物制药的cGMP生产更容易实现。结合可快速组装的模块化结构，一次性生产成为一种可以在全世界范围内扩展生物制药的技术。
2.4 表达量的提高
最近几十年来，细胞培养的表达量也有显著提高。如今，经14天的批培养后，单抗通常可以达到5 g/L的表达水平。而通过流加生物反应器的持续补料还可以获得更高的表达量。这些进步是由细胞系表达载体的开发、克隆筛选以及细胞培养基的变化所获得的。这种产品表达的增加反过来也促使小型生物反应器(例如2000L一次性生物反应器)能够用于商业生产。
2.5 下游工艺新技术
上游工艺生产率的提高导至下游工序成为生产瓶颈。尽管有人认为目前使用的固定层析工艺能够满足数吨单抗的生产要求，但人们对纯化技术的兴趣仍在增加，以期望其显著提高生产率。近期热点包括对连续生物处理(通常用于连续流加培养和下游操作)，以及可以大规模使用的非层析技术。 另一个重新引起关注的领域是非层析分离方式，在这种分离方式可以完全摆脱对层析柱的依赖。
2.6 新一代抗体结构
导至平台方法进化的另一个主要因素是特定的单抗类似构造正被开发为潜在的治疗手段。生物技术产业正迅速超越传统的单抗，涉足包括Fc融合蛋白、双特异性抗体(bsAbs)和融合蛋白在内的各种结构。这些新构造都需要调整原有的单抗平台工艺来支持它们的生产。
Fc融合蛋白是通过将单抗的Fc区域的编码序列与另一种蛋白质的编码序列连接后表达的。Fc区域作为融合部位具有几个优势。许多生物活性肽和蛋白质表现出在肾脏的快速清除，血浆半衰期较短。Fc区域可以与新生的Fc受体结合，延长抗体的半衰期，同时对融合部分也有同样作用。已经批准上市7个Fc的融合蛋白，其中至少有两种(Enbrel和Orencia)每年销售额超过10亿美元，达到重磅炸弹级别。安进公司的单抗原始平台包括了Fc融合蛋白的纯化。然而，对于Fc融合蛋白来说，存在几个关键的下游差异，包括对蛋白裂解的敏感性和比常规的单抗更高的高分子量聚集(HMW)水平的可能性。典型的单抗下游平台方法经过适当调整洗脱条件后通常是可行的，以保证分子的稳定性和多聚体的有效清除。
双特异性抗体(bsAbs)设计为能够同时结合和中和两种不同抗原(配体、细胞受体或细胞因子)或两种不同靶点的蛋白质。由于这一特性，双特异性抗体可以作为调节剂，将免疫效应器和细胞毒性因子，如T细胞，转移到肿瘤或感染细菌内部。抗体的两个手臂不同，这就导至了双特异性抗体的生产工艺的几个挑战。例如，如果抗体的两个单元分别表达，下游工艺需要拆分为两个半部分，然后重新组装以形成一个异质二聚物。除非采用重组工艺，即使采取抑制同二聚物的形成(通过使用一种孔-穴方法或类似的技术以促进异质二聚物的形成)，仍会形成少量的同源二聚物，需要在下游处理工艺中移除。因此，这种双特异性抗体的构造需要一个更复杂的下游工艺。
然而，使用一个普通的轻链和孔眼技术(KiH)可以使在细胞培养表达双特异性抗体。由于KiH的构造，使均质聚物的形成受到抑制。如果所选的序列具有生物化学的差异，那么形成的少量的同源二聚物就可以被移除。即使在没有共同的轻链的情况下，也可以做到这一点。例如，来源于Xencor的X单抗技术中，同质二聚物和异质二聚物在其设计的Fc区域中有微小的差异，使它们能够在CEX中分离。该工程改造的另一个目的是提高双特异性抗体的功能效应。
抗体偶联药物(ADC)是一种抗体与细胞毒性剂偶联的一种药物，其主要用于癌症治疗。ADCs下游工序的末端，化学接合步骤除外，其余下游工艺与传统的单抗相同。而这通常需采用超滤/过滤工艺移除未偶联的小分子。与单抗的主要区别在于，由于连接分子的毒性，需要更严格的控制和人员保护。
其他的下一代单抗结构包括在C或N端上对抗体进行融合，以进一步增强同时结合多个靶点的能力。如与抗体结构融合的抗溶蛋白。如图1所示，包括工程scFvs、双抗和三抗，以及以二聚物或三聚物的形式组成的Fab偶合体。如果这些治疗模式成为一种治疗模式，将会导至平台工艺方法的发展。
图1 下一代抗体的可能结构
