单抗生产工艺的发展趋势（二）
3.1 单抗平台发展驱动
本节概述了几家大型生物制药公司开发并成功地用于大规模生产单抗生产的下游工序。在这些工艺流程中几个方面是通用的。在哺乳动物细胞培养过程中，单抗被分泌到细胞外的培养基中。收获和复苏规程通常采用离心法，然后是深层过滤和一系列的膜过滤器。如果规模较小，可以使用离心分离法，使用一系列的深层过滤器，这些过滤器通常可以重复使用。平台工艺几乎都是蛋白质A的亲和层析。在某些情况下，可以在蛋白质A层析中增加选择性洗脱方式，从而进一步增强宿主细胞蛋白(HCP)的清除能力。非蛋白A的方案已经被开发出来并用于某些治疗蛋白质商业生产，但由于缺乏通用的方法和处理过程的稳健性，所以尚未普遍应用。按照WHO指导原则，工艺应包含两个不同原理的病毒清除工序。低pH病毒活性和纳滤广泛应用于单抗生产。低pH经典方法是蛋白从蛋白质A层析洗脱后，立即置换低pH值的缓冲液中。蛋白A亲和层析和病毒灭活后，采用一种或两种精制层析法来清除高分子量聚合体、宿主细胞蛋白、DNA，并清除潜在的病毒。各平台方法的主要区别在于不同原理精制层析步骤的顺序。鉴于目前在工业中日益普遍的高表达细胞培养过程(5-10g/L)，要求精制层析工艺上有很高的柱载量。
每个公司最终都会根据自己的表达系统和细胞培养过程以及他们在研发中主要使用的单抗类型和子类来定制单抗下游平台的方法。主要的标准是，平台方法需要在不经过显著修改的情况下，在广泛的IgG分子中保持健壮和适用。另一个关键的标准是，平台能够适应生产进度，并尽可能减少在下游处理过程中所花费的时间。因此，另一个关键的驱动因素是各个精制工艺的载量。
3.2 单抗下游平台现状
安进公司是率先披露其下游工艺平台的公司之一。完全模板化的方法被证明是不可行的，但是进行少量的开发实验即可得到符合要求的工艺参数。这些工艺参数的例子包括：蛋白质的洗脱pH值和洗脱层析步骤的选择，这取决于需要清除的杂质的主要成分。图2显示了当时在安进公司中使用的下游平台方案。典型的精制工艺通常采用先阳离子交换层析(CEX)吸附模式，再根据需要采用疏水层析(HIC)的流穿模式去除高聚物，或采用阴离子交换层析(AEX)去除HCP。在少数情况下，会使用羟磷灰石以去除特定的与产品相关杂质。经过第一步精制CEX工序使HCP和HMW达到要求后，采用了AEX膜层析作为第二步病毒灭活工艺。
基因泰克公司另一家率先利用平台方法开发了一种单抗工艺的公司。基因泰克历史上使用CEX和AEX层析法作为其下游平台的一部分(图3)，这一趋势最初是利用CEX的结合与洗脱模式作为第一个精制步骤，然后AEX流穿模式。一般单抗的pI显碱性，因此容易与CEX填料紧密结合，也容易在AEX填料中流穿。CEX步骤清除了HMW和HCP。然而，AEX的步骤是需要低电导率才能成功地去除HCP。AEX上样前需要大体积的储罐负荷这可能会导至在操作过程中出现瓶颈。使用混合模式的Captoadhere填料代替传统的AEX填料，有助于减少高倍稀释的需要。
使用AEX的一个主要缺点是只能清除HCPs而不能清除HMW聚合物。可以在优化AEX工艺，采用弱分离模式可以减小这个缺陷，只是这种情况下会有一部分产品保留在填料上。在这种操作模式下，AEX工艺在去除HCP的同时还可去除部分HMW。我们从结构上推测，在电导率非常低条件，填料骨架的某些疏水性部分相互作用能去除部分HMW。
图2 安进公司的单抗下游工艺平台方法
上述两种方案都有一个缺点，即要求对AEX步骤进行大量稀释。此外，CEX和AEX通常无法达到足够的HMW清除效果。
不同单抗HMW水平不一致，但经蛋白质A层析后的HMW的浓度一般不超过5%。这样的水平常常需要像前面提到的那样，采用HIC工艺。另一种创新方法是在不加盐的条件下，高上样量(200g/L)下进行HIC工艺操作。
这种方法需要使用一种高度疏水性的HIC填料，而不需要增加额外的高渗性盐。调节上样前的pH值，以在这种高度过载条件清除HMW。使用这种超高容量的步骤，可以处理大量的单抗，并作为Biogen(图4)的单抗平台的一部分，与AEX流穿模式一起使用。超高上样量精制工艺能力使层析循环数减少，也减少了批生产的上样时间。
图3 基因泰克单抗下游工艺平台
Millipore-Sigma讨论过一种几乎完全采用流穿模式精制的方案。在这种建议中，CEX采用高度过载模式上样。这样操作时，CEX有一定能力清除HCP。我们同样推测，这是由于与层析填料的疏水相互作用造成的。该精制工艺最后以AEX流穿模式完成整个工艺。
图4 Biogen公司单抗下游工艺平台
合同开发和制造(CMDO)需要将许多不同的细胞系和细胞培养过程融入到下游平台方法中。因为需要同时去除HCP和HMW，这对下游平台方案来说是个重大挑战。对下游单抗平台的各种需求如图5所示。不同的细胞系和培养基种类存在很多的可变性，这些都下游工艺平台进行处理。因此，两步精制工艺都需要可以同时清除HMW和HCP。
图5 确定KBI生物制药平台方法所考虑的因素范围
