化学发光免疫分析法几个常见问题及处理办法
化学发光免疫分析法（ CLIA ）是将化学发光与免疫反应相结合而建立起来的用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异度，并且具有无放射性危害、自动化程度高等优点，目前已趋于代替放射免疫分析（ ＲＩＡ ）和酶联免疫测定（ ＥＩＡ ）而成为临床免疫检测中应用最广泛的分析技术 。笔者从事 CLIA 免疫检测10余年，遇到过许多问题，现把日常工作中几个常见问题和处理办法进行总结如下。
1，钩状效应
“钩状效应”是指免疫检测中使用双抗体夹心法时，抗原抗体反应在比例适中时形成的检测信号与所测的抗原或抗体水平呈正比关系，但当抗原或抗体的水平超过一定界限时，检测信号反而随着水平的增加而下降的现象。CLIA 本质上还是利用抗原抗体反应原理对微量物质进行检测，所以同样存在钩状效应的问题。在 CLIA 免疫检测中，最容易出现钩状效应的检测项目包括甲胎蛋白（ＡＦＰ）、催乳素（ＰＲＬ）、雌二醇（Ｅ２ ）和人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）等，主要原因是这些项目在健康人群血液中的水平很低，一旦患上某些疾病或在某些特殊情况下（如用药和怀孕）其水平却可明显上升，有的上升幅度可高达百万倍，如 原 发 性 肝 癌 患 者 ＡＦＰ 可 上 升 至1092—
700ng／ｍＬ，笔者也检测过葡萄胎患者ＨＣＧ可高达2735-698ｍＩＵ／ｍＬ ，远远超出这些项目所能检测的线性范围。解决钩状效应最好的办法就是对标本进行稀释后检测，结果再乘以稀释倍数。
现在的全自动 ＣＬＩＡ 仪都具备对一些检测项目自动稀释的功能，对一些需要稀释后检测的标本，仪器若具有自动稀释功能，则建议选择仪器自动稀释，这样可以避免手工稀释过程中产生的一些误差和计算错误；仪器不能自动稀释而采用手工稀释时，应用精密加样枪先吸取稀释液，再吸取标本，为了避免加样枪吸头腔内标本残留对测定结果造成较大影响，当标本排入稀释液后必须用该稀释液对吸头腔内冲洗 ２～３ 次。稀释液最好是用该项目的专用稀释液或者是该项目的 “ ０ ”水平定标液，这样可以避免产生基质效应，保证标本检测结果的准确性。
有些实验室没有购买专用稀释液，在“ ０ ”水平定标液也没有多余的情况下，也可用该项目已知较低水平的血清作为稀释液，但结果需按下列公式计算：测定结果 × 稀释倍数 － 已知血清水平×（稀释倍数-1）。由于ＣＬＩＡ分析仪对发生钩状效应不能识别，不会报警提示，在日常检测工作中钩状效应往往很难被及时发现。因此，要求检验人员在工作中要具有高度的责任心，不能对仪器检测结果照单全收，对结果要加以详细分析和解读；对近期有相同项目多次检测的结果要加以对比，分析多次结果之间变化是否在可接受范围内；遇到检测结果与临床诊断严重不符时要密切与临床医生保持沟通，必要时对标本进行重新检测或稀释后检测，尽最大可能把钩状效消灭在实验室内。
2，偶然误差
CLIA 免疫测定是一种高度敏感的微量测定技术，任何一个操作环节出现纰漏，都有可能出现错误的结果。在日常工作中经常会碰到这种情况：同一份标本，同时对同一个项目做２次测定，结果相差很大，其中一个结果最终被证实为准确的，那么另一个异常结果通常都是由偶然误差所致。
引起偶然误差的原因有很多，常见的有以下几方面：
２.１ 标本方面
标本量不充足、标本液面有气泡、标本受到污染、稀释标本没充分混匀、特别是标本前处理不合格等因素都很容易引起偶然误差。在日常工作中有时为了赶时间，在标本还没完全凝固就强行离心检测，这样就很容易导致离心不彻底，血清中含有纤维蛋白，有时纤维蛋白比较细小没被发现，上机检测时如被采样针吸到就容易造成吸样不足或发生堵孔，引起偶然误差。处理办法：（ １ ）采用分离胶真空采血管采集标本；（ ２ ）用普通采血管采集标本后应先放置水浴箱水浴 20min ；（ ３ ）用离心半径大于８ｃｍ 的离心机3000r／ min离心10min，离心完成后要仔细检查标本分离是否彻底，建议把血清移至专用标本杯进行检测。
２.2 仪器方面
当存在缓冲液或发光剂液路内混入气泡，加样针和清洗针太脏，与排液或吸液有关的泵或阀门故障，超声系统故障等因素时也会引起偶然误差。处理办法：按规定要求对仪器每天、每周、每月进行各项保养，每天操作前先对仪器各液路、加样针和清洗针进行灌注冲洗，更换底物要对底物液路进行灌注，定期对仪器各系统构件进行维护，保持仪器随时处于最佳工作状态。
２.3试剂方面
试剂变质失效，试剂混匀不充分，试剂混匀时产生过多气泡，试剂量不足等因素同样会产生偶然误差。笔者曾经遇到过用贝克曼 Ａｃｃｅｓｓ２ 全自动 ＣＬＩＡ 仪对同一份标本做 Ｂ １２ 多次检测，每次结果都不相同，结果分布从几十到上千ｐｇ ／ ｍＬ 不等，用质控品做也如此，换了新试剂对该标本进行重复试验时结果就比较稳定，质控结果也在规定范围内，很明显，这种情况是该试剂出了质量问题，必须马上进行更换；在做甲状腺功能检测时多次遇到过只有血清总甲状腺素（ ＴＴ４ ）一个结果特别异常，结果常超过该项目的测试上限（ ＞30ug ／ｍＬ ），而 其 他 几 个 项 目，包 括 血 清 游 离 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸（ ＦＴ３ ）、血 清 游 离 甲 状 腺 素 （ ＦＴ４ ）、总 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸（ ＴＴ３ ）、促甲状腺激素（ ＴＳＨ ）检测结果都在正常范围内，用同一标本重新进行复查后结果马上变为正常，此时用质控品检测结果也在控，经多次反复试验后发现，出现这种情况是由于仪器超声系统对该项目试剂放置太久（如试剂放置过夜）后一次混匀不够充分所致。处理办法：（１）坚持每日开展室内质量控制，要求批间精密度（ cv）＜１０％ ；（２）运行该项目前必须先手工对该试剂进行充分混匀（注意：手工混匀试剂时不可使试剂溢出或产生过多气泡）。
３，定标失败
在给试剂定标时经常会遇到定标失败的情况，引起定标失败的原因也比较多，除了能引起偶然误差的试剂、仪器等方面的原因外，定标液本身也是引起定标失败的常见原因。当出现定标失败时，首先要检查仪器提示的错误信息内容，查看定标数据是否完整，观察各点结果精密度，各点测定值与定标卡上的值是否接近，定标曲线的形状等，找出定标失败的具体原因，然后采取相应措施，解决定标失败问题。以贝克曼 Ａｃｃｅｓｓ２全自动 ＣＬＩＡ仪为例，具体判断如下。
３.1定标结果缺失某一点数据
导致定标结果缺失某一点数据可能原因是该点定标液量不足，或者是 ＲＶ杯探测器脏不能正常探测到 ＲＶ杯的存在。处理：按定标需要量加足定标液；用７５％酒精棉签擦拭 ＲＶ杯探测器。
３.2 某一点测定结果精密度超过规定范围
某一点定标液受到污染，或者是缓冲液或发光剂液路混入气泡。处理：更换新定标液；检查液路并进行冲洗灌注。
３.3各点测定结果精密度都超过规定范围
定标液或试剂盒可能受到污染，也可能是仪器存在问题。处理：更换新定标液或试剂盒，对仪器进行保养和校准。
３.4 测定值与定标卡上的值相差太大
如精密度在规定范围内，可能是定标液批号出现错误；如精密度超出规定范围，则按上面测定结果精密度超出规定范围加以判断和处理。
３.5定标曲线非平滑上升或下降
定标液位置摆错或是某一水平定标液受到污染可能导致定标曲线非平滑上升或下降。处理：按定标液从低水平至高水平的顺序正确摆放；更换新定标液。
３.6定标曲线非常平坦
定标曲线非常平坦，ＲＬＵ 值均很高（竞争法），原因可能是使用了不同项目的定标液或试剂盒。处理：更换错误的定标液或试剂盒。定标曲线非常平坦， ＲＬＵ 值均很低，可能原因为使用了不同项目的定标液或试剂盒（夹心法）；发光底物用完或发光底物液路堵塞。处理：更换错误的定标液或试剂盒；更换发光底物或检查液路情况。
４, 同一实验室对多台不同品牌 CLIA 的管理
随着 CLIA 技术的迅猛发展，新技术的不断应用，尤其是吖啶酯类、鲁米诺类发光剂的合成，以及超弱光检测技术的发展，使 CLIA 技术的各个优点得到充分体现。现在各级医疗机构实验室普遍都把 CLIA 技术作为一个主要检测手段加以推广应用。
我国目前所用的 CLIA 仪基本上都是引进国外的仪器及其配套试剂，而生产这些仪器和配套试剂的各个厂家都是各自研发、按照各自的标准体系进行生产，大多数项目的检测方法各不相同，这对一个实验室同时拥有多台不同品牌 ＣＬＩＡ 仪该如何科学、合理使用提出了一个新的课题。有关比对研究一致认为，当同一个实验室同时有两台或两台以上 ＣＬＩＡ 仪检测同一项目时，应该定期对各台仪器检测结果进行相关性分析和偏倚评估，以确保各台仪器测定同一项目时结果具有可比性和一致性 。
笔者工作的实验室也有多台不同品牌的 ＣＬＩＡ 仪，经过多年的探索，笔者认为，当一个实验室同时拥有多个品牌 ＣＬＩＡ仪时，每个品牌 ＣＬＩＡ 仪没必要对相同项目都开展检测，应根据现有仪器各自优势项目进行合理安排。例如一个实验室同时拥有雅培、贝克曼和罗氏三个品牌的 ＣＬＩＡ 仪，那么可以把病毒检测系列、激素类项目、肿瘤标志物类项目分别安排在雅培、贝克曼和罗氏等品牌的 ＣＬＩＡ 仪上进行检测，其他发光项目可以根据各个仪器特点、标本量、急诊需要、夜班情况进行相应安排。这样就不用每个项目都要在每台仪器上进行定标和质量控制，节省了大量定标液、质控品和试剂，对检测结果也更加有保证，同时也省去了不同仪器检测同一项目时所需要进行的相关性分析和偏倚评估的大量繁琐工作，况且不同品牌的 CLIA 仪由于方法不同，标准也不一样，所检测的结果根本上就没有太多的可比性，这与徐淼玲等 和宋超等 所做的研究结果基本一致。
５，与其他方法检测结果不一致
CLIA 检测结果和其他方法检测结果不一致的情况也比较常见，笔者曾遇到过用胶体金试纸条检测血清 ＨＣＧ 结果为明显阳性，用 CLIA 检测结果却为阴性的情况；用酶联免疫吸附试验（ ＥＬＩＳＡ ）检测乙型肝炎表面抗原和丙型肝炎抗体结果皆为阴性，用ＣＬＩＡ检测结果却皆为阳性；用 ＣＬＩＡ 检测梅毒螺旋体抗体结果阳性，用梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（ ＴＰＰＡ ）结果却为阴性等情况。碰到这些检测结果不一致时，要先从检测的方法学上进行分析。一般认为， ＣＬＩＡ 的灵敏度要比胶体金、 ＥＬＩＳＡ 、凝集试验等方法高很多，所以在检测指标水平很低的情况下， ＣＬＩＡ法可以检测到阳性结果而其他方法却不能；相反，如果ＣＬＩＡ 检测结果为阴性而其他方法检测结果为阳性，那么就要考虑阳性结果是否受到非特异性物质的干扰。任何一项检测技术的特异性都不可能达到１００％ ， ＣＬＩＡ检测技术也一样，当其他方法检测结果为阴性而 ＣＬＩＡ 检测结果为阳性时也要考虑到假阳性结果存在的可能性，尤其是对病毒类的检测，当 Ｓ/CO值在 １～５ 时 ＣＬＩＡ 检测出的真阳性率其实并不高 。因此，当出现ＣＬＩＡ检测结果与其他方法检测结果不一致时，要多与临床医生沟通，应结合临床症状、疾病史和其他检验结果加以综合分析，必要时进行定期复查或者用其他方法进行检查，做到既不误报也不漏报。
CLIA 继承了 ＲＩＡ 的所有优点，同时克服了 ＲＩＡ 和 ＥＩＡ各自的缺点，目前是临床免疫检测最理想的新技术，其取代ＲＩＡ 和 ＥＩＡ 是临床免疫检测发展的必然趋势。ＣＬＩＡ 在为临床诊断、疗效评估、药物水平监测等方面提供大量、可靠、及时的检测数据的同时，如果某个操作环节稍微没控制好，或者在检测的过程中出现某些问题没处理好，也会出现一些误导性结果，给临床造成困惑、误诊或者漏诊。因此，在应用新技术的同时，也要把好质量关，除了按要求对试剂进行保存和定期定标、对仪器进行按时保养，坚持室内质量控制，积极参加室间质评外，还要对一些日常工作中经常出现的问题采取正确的处理措施，使 ＣＬＩＡ 检测结果的准确性得到充分保证.
