HRP标记抗体-简易过碘酸钠法
实验概要
本实验用简易过碘酸钠法进行HRP标记抗体。本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
实验原理
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
主要试剂
1. 0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
2. 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml；0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml；加蒸馏水至2,000ml。
3. 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸馏水至50ml，再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
4. NaBH4溶液(4mg/ml)：临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。
5. 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
实验步骤
1. 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
3. 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
4. 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
5. 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃ 2小时。
6. 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
7. 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1小时。
8. 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
9. 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
10. 结果判定
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
